雙光子激發熒光（TPEF）顯微鏡是對活體(ti) 組織深層三維成像的第1方法，較長的波長就有較低的散射和更高的對比度，飛秒激光器較高的平均功率可能對樣品帶來光損傷(shang) ，較高的峰值功率具有更高的激發效率。西班牙FYLA国产黄色在线观看SCH全光纖超連續譜全光纖激光器，脈衝(chong) 寬度短至15fs，與(yu) 傳(chuan) 統的100fs激光器相比，SCH可在相同平均功率水平下提供超過傳(chuan) 統飛秒激光器7倍的光子通量，同時得益於(yu) 其超寬的光譜範圍，可同時激發多種熒光探針，讓多色雙光子顯微成像變得更簡單。
雙光子顯微成像用飛秒激光器
雙光子激發熒光（TPEF）顯微鏡，也稱為(wei) 雙光子顯微鏡，是對活體(ti) 組織深層三維成像的第1方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(you) 勢，它使用了更長的激發波長（通常是近紅外波段），因而其帶來的散射比傳(chuan) 統共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見波長更少。更長的波長同時也減少了來自散射光的背景照明，並增加了在更高深度處的對比度。目前，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體(ti) 內(nei) 大腦圖像。
在熒光顯微鏡中，當兩(liang) 個(ge) 獨立的光子被一種介質同時吸收時，就會(hui) 發生雙光子激發。這需要兩(liang) 個(ge) 合適能量的光子在這樣的介質上時間和空間上同時重合；通常來說這不需要非常大的激發光子通量，當然光子通量越大， 雙光子同時被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會(hui) 帶來更高的效率，從(cong) 而帶來圖像質量和分辨率的提升。
在TPEF顯微鏡中，雙光子激發所需的大光子通量更多的是通過寬波段可調諧的鈦寶石飛秒激光器實現的，激光器典型規格脈寬為(wei) 100fs，重複頻率約為(wei) 80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器較高的平均功率（在1~4瓦範圍內(nei) ）會(hui) 由於(yu) 激發波長的線性吸收引起的與(yu) 介質的光熱相互作用而造成熱損傷(shang) 。這種效應在體(ti) 內(nei) 成像中尤其重要，因為(wei) 溫度超過40ºC會(hui) 導致不可逆的損傷(shang) 。因此，傳(chuan) 統的固態激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實際国产成人在线观看免费网站於(yu) TPEF顯微鏡，峰值功率也會(hui) 相應地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷(shang) ，同時縮短脈衝(chong) 持續時間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質上的時間間隔，同時提高了介質被吸收的概率。
近日，西班牙FYLA国产黄色在线观看首次利用超連續譜全光纖激光器技術得到脈衝(chong) 寬度短至15fs的商業(ye) 激光器，命名型號“SCH”。與(yu) 傳(chuan) 統的100fs激光器相比，SCH的15fs脈衝(chong) 寬度可在相同平均功率水平下提供超過傳(chuan) 統飛秒激光器7倍的光子通量。
圖1：FCH 寬光譜光纖飛秒激光器，波長範圍950-115nm，脈衝(chong) 寬度15fs, 峰值功率>200kW
圖2：藍色線：SCH 飛秒激光器光譜曲線；橙色線：1um波段百秒激光器光譜曲線；灰色線：紅色熒光蛋白DsRed吸收截麵光譜
但是，巨幅提高每個(ge) 時間和麵積上可用光子數量對圖像的真正影響是什麽(me) 呢？
一、更高的激發效率，更高的圖像亮度
理論上，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與(yu) 激發效率直接相關(guan) ，而激發效率完全依賴於(yu) 光子通量和熒光團的二階非線性激發截麵(GM) 。作為(wei) 一個(ge) 例子，我們(men) 可以嚐試計算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬（如SCH飛秒激光器）和1050nm中波長照射下的激發效率。與(yu) 100fs的激光器相比，15fs激光器具有更寬的帶寬（達200nm），可以在900到1200nm之間激發mRFP，與(yu) 100fs激光器的11nm相比，這是一個(ge) 更寬的光譜區域。
圖3：藍色曲線：以1050nm為(wei) 中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率； 橙色曲線：以1050nm為(wei) 中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截麵(GM)
考慮到各波長的峰值功率和激發截麵，可以計算出mRFP的激發效率。結果表明，與(yu) 傳(chuan) 統100fs激光器相比較，SCH飛秒激光器15fs的脈衝(chong) 寬度使得激發效率提高了50%。
圖4：藍色曲線：SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率； 橙色曲線：100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截麵(GM)
圖5：小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡圖像，用SYTOX Green標記細胞核（黃色）和Alexa Fluor 568煥鈦標記肌動蛋白絲(si) （藍色）
二、多色同時激發
想象一下，同時成像多個(ge) 波段範圍的熒光團，而不必考慮選擇非常好的激發波長激光器。在雙光子顯微鏡中，使用傳(chuan) 統的100fs激發激光器，這通常是一個(ge) 複雜的，有時甚至是不可能完成的任務。傅裏葉變換極限的100fs近紅外固體(ti) 飛秒激光器（例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器）的光譜寬度通常在10~20nm範圍內(nei) ，它們(men) 隻能同時激發激發光譜在10~20nm光譜範圍內(nei) 的熒光團。因此，若想用單台激光器去同時激發更多種類的熒光團就需要帶寬更寬，脈衝(chong) 更短的激光器。
SCH寬光譜飛秒激光器在提供15fs脈衝(chong) 寬度的同時以1050nm為(wei) 中心波長提供200nm的帶寬，在這個(ge) 帶寬範圍內(nei) （橫跨900到1200nm）的所有綠色和紅色的熒光團都可以同時被這種激光器激發。這對於(yu) 雙光子顯微鏡來說，同時對多個(ge) 熒光團成像成為(wei) 一個(ge) 可行的，實用的和簡單的替代。
圖5：常見熒光探針激發波長
圖6：小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡圖像
用Sytox Green標記細胞核（洋紅色），FITC濾波器；用Alexa Fluor 568 Phaloidin標記肌動蛋白絲(si) （綠色），TRITC過濾器。
兩(liang) 種熒光標記物同時被SCH激光器激發，用尼康的熒光濾片組過濾熒光。
Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain.
綜上所述，FYLA国产黄色在线观看推出的新型、緊湊而強大的SCH全光纖飛秒激光器激光器，提供15fs的脈衝(chong) 持續時間和高峰值功率（>200kW），為(wei) 體(ti) 內(nei) 樣本的低光損傷(shang) 激發提供了強大的工具。結合全光纖激光器的緊湊性和堅固性性，SCH飛秒激光器成為(wei) 雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。
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