鑒於(yu) 生命係統的動態和複雜特性，幾乎不可能憑借極小的局部區域的特征來預測係統性行為(wei) 。要研究係統的生物學特性，例如跨皮質區域的神經網絡活動、白細胞運輸動態或腫瘤轉移，需要一台至少具有毫米級視場和亞(ya) 細胞分辨率的顯微鏡以視頻幀率來記錄動態的生物活動。這需要具有高空間帶寬積(分辨率X視場）的光學係統和具有高數據吞吐量(像素數X幀率)的采集係統。最近發明的Mesolens顯微鏡，已經展示出大視場下高分辨率成像能力。在共聚焦掃描模式下，Mesolens 可以從(cong) 毫米級樣本中收集大量信息，並已用於(yu) 對整個(ge) 固定的 12.5 天大的完整小鼠胚胎進行成像。
厘米尺度和微米分辨率的生物動力學視頻幀率成像
技術背景：
鑒於(yu) 生命係統的動態和複雜特性，幾乎不可能憑借極小的局部區域的特征來預測係統性行為(wei) 。要研究係統的生物學特性，例如跨皮質區域的神經網絡活動、白細胞運輸動態或腫瘤轉移，需要一台至少具有毫米級視場和亞(ya) 細胞分辨率的顯微鏡以視頻幀率來記錄動態的生物活動。這需要具有高空間帶寬積(分辨率X視場）的光學係統和具有高數據吞吐量(像素數X幀率)的采集係統。最近發明的Mesolens顯微鏡，已經展示出大視場下高分辨率成像能力。在共聚焦掃描模式下，Mesolens 可以從(cong) 毫米級樣本中收集大量信息，並已用於(yu) 對整個(ge) 固定的 12.5 天大的完整小鼠胚胎進行成像。
光學係統與(yu) 尺度相關(guan) (scale-dependent)的幾何像差從(cong) 根本上限製了顯微鏡的 空間帶寬積，使得可實現的分辨率和視場是一對矛盾量。當前有兩(liang) 種方法可以繞過這個(ge) 難題：（1）圖像拚接，大尺度的樣本通過逐個(ge) 小區域掃描完成整體(ti) 采集；(2) 傅裏葉疊層成像，使用大視場、低分辨率成像係統，通過采集大量不同照明條件下的大視場低分辨率圖像，在傅裏葉域進行後處理獲得最終圖像。不幸的是，它們(men) 在高分辨率下的性能代價(jia) 是犧牲了時間分辨率。例如，在傅立葉疊層顯微鏡中獲得十億(yi) 像素圖像需要大約 3 分鍾。這些技術的數據吞吐量遠不足以支持單次、全視場信息采集。此外，在這兩(liang) 種情況下，整個(ge) 視場成像的全過程中樣本都需要保持靜止，這在活體(ti) 成像中是很難實現的，對清醒、活動的動物成像時更甚。當需要高速成像時，必須選擇感興(xing) 趣的小區域。因此，它們(men) 不可能用於(yu) 生物動力學的大尺度成像。對於(yu) 高空間帶寬積天文學，已經提出了非平麵成像表麵的望遠鏡，成功地減輕了設計和製造方麵的挑戰。
當前不足：
對於(yu) 係統生物學中非常需要的動態成像，Mesolens顯微鏡數據吞吐量有限。例如，在具有亞(ya) 細胞分辨率的哺乳動物皮層全腦功能成像中，以視頻速率(>10 fps用於(yu) 鈣成像)采集，成像係統應具有 ~10 mm × 10 mm 視場，~1 μm 分辨率，相應的數據吞吐量應大於(yu) 每秒 4 gigapixels。在19年本文發表前，這樣的係統還未出現。
非平麵成像表麵的望遠鏡設計是鼓舞人心的，但將這樣的策略從(cong) 望遠鏡轉向顯微鏡並非易事。
文章創新點：
基於(yu) 此，清華大學的Jingtao Fan(第一作者)和Qionghai Dai(通訊作者)提出了一種實時、超大尺度、高分辨率成像的宏觀顯微鏡(macroscope)，它實現了厘米級尺度(10mmX12mm)和微米級分辨率(525nm時橫向分辨率0.92um)的生物動力學視頻速率(30fps)、十億(yi) 像素(gigapixel)成像，數據吞吐量高達 5.1 gigapixels/秒。
（1）物鏡采取平麵-曲麵的成像策略，設計全新的顯微物鏡成像光路，實現物鏡將物方大視場的平麵與(yu) 像方的凹形中間像麵對應，從(cong) 而極大的減小幾何像差(特別是場曲)。
（2）采集單元鏡頭采取曲麵-平麵的成像策略，受昆蟲複眼的啟發，凹形中間像麵被分成35個(ge) 小視場，並被35個(ge) 中繼鏡頭組(采集單元)重新成像到平麵scmos上，scmos水冷處理至10℃，保持低噪聲水平。
原理解析：
（1）降低幾何像差，放大中間像麵。當視場和數值孔徑變大時，場曲和其它幾何像差會(hui) 迅速增加。獲得均勻分辨率的大的平麵像需要極度複雜的光學設計，實現起來很困難。采用曲麵像麵設計策略，可以極大的減小如場曲這樣的幾何像差。如圖1a，設計一個(ge) 14片的物鏡(直徑161mm，長280mm，0.35NA ，使用Zemax設計)，成半徑為(wei) 1.9m的凹麵中間像麵以與(yu) 場曲適配。如此大的半徑的曲麵，便於(yu) 下一步的子視場分割及並行采集。
（2）子視場分割，並行采集。將凹麵視場分成35個(ge) 子視場，用35個(ge) 中繼鏡頭組並行采集，每個(ge) 子視場的主光線垂直於(yu) 中間像麵，相鄰子視場重疊率為(wei) 3.6%，如圖1a。
（3）校準和裝配。采取快速計算在環(computation-in-loop)的校準策略，獲得亞(ya) 像素的校準精度，並提供用於(yu) 組裝相機陣列所需要的反饋。如圖2，第一步：使用高密度的LCD模組(500PPI)上不同單元的時分編碼來設置全局物理坐標，具體(ti) 來說，12-bit時間編碼分別用於(yu) x和y坐標；第二步：每一個(ge) 子視場相機采集LCD上一個(ge) 特定小區域的圖像序列，因此每個(ge) LCD單元上相應的全局位置可以通過時間模式編碼；第三步：對每個(ge) 子視場圖像裏的LCD單元，使用麵積中心(centre-of-area)方法(包含二值化和權重平均)進一步提取精確的局部圖像坐標；第四步：獲得所有子視場的局部和全局坐標後，建立一組單應矩陣(homographic matrices){Hi}用於(yu) 無縫連續拚接。
（4）采集，存儲(chu) 和無縫拚接。設計一個(ge) 九節點的計算機集群來適應傳(chuan) 輸、存儲(chu) 和處理所需的巨大帶寬(見圖3)。通過這種設置，35 張圖像（每張 5.5 百萬(wan) 像素）被同步連續捕獲，最大幀率高達 30fps。捕獲的數據通過雙攝像頭鏈接傳(chuan) 輸到光纜。在35線雙工光網絡(35-cable duplexing optical networks)中，圖像傳(chuan) 輸帶寬達到每秒5.1 千兆像素，實現了一個(ge) 帶有 324 個(ge) 硬盤（每個(ge) 4TB）的分布式文件係統。該分布式文件係統用於(yu) 調度本地數據寫(xie) 入請求到每個(ge) 節點，並使用元數據集群機製提供跨節點數據交換能力，促進了高度並行且粒度(granularity)可調的分布式拚接算法。因此，可以根據感興(xing) 趣的區域實現自適應分辨率調整的實時在線拚接，並且可以以高達 1.1 fps 的速度對整個(ge) 十億(yi) 像素視頻進行拚接和離線存儲(chu) 。
視頻1：清醒小鼠血管和鈣信號的成像
視頻2：小鼠神經活動的鈣成像
附錄：
參考文獻：Fan, J., Suo, J., Wu, J. et al. Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution. Nat. Photonics 13, 809–816 (2019).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41566-019-0474-7
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