因為(wei) 各種化學鍵有其特征頻率，使得基於(yu) 紅外吸收和拉曼散射的振動顯微術可被用作為(wei) 無標記對比度機製。然而使用長波長的紅外顯微鏡的分辨率不夠，使用短激發波長的自發拉曼散射顯微鏡盡管有高分辨率，但是其靈敏度不夠，成像速度不足。相幹反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)顯微鏡的靈敏度要高於(yu) 自發拉曼散射顯微鏡，但是因為(wei) 非共振背景的存在，限製了其探測靈敏度。
基於(yu) 受激拉曼散射顯微鏡的高靈敏度無標記生物醫學成像
技術背景：
因為(wei) 各種化學鍵有其特征頻率，使得基於(yu) 紅外吸收和拉曼散射的振動顯微術可被用作為(wei) 無標記對比度機製。然而使用長波長的紅外顯微鏡的分辨率不夠，使用短激發波長的自發拉曼散射顯微鏡盡管有高分辨率，但是其靈敏度不夠，成像速度不足。相幹反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)顯微鏡的靈敏度要高於(yu) 自發拉曼散射顯微鏡，但是因為(wei) 非共振背景的存在，限製了其探測靈敏度。
受激拉曼散射(stimulated raman scattering,SRS)於(yu) 1968年初次觀測到，隨後在許多光譜研究中得到廣泛的国产成人在线观看免费网站。在自發拉曼散射中，由於(yu) 非彈性散射的機理，一束頻率為(wei) wp 的激光束照射樣品，生成頻率分別為(wei) wS 和 wAS的斯托克斯和反斯托克斯信號。在SRS中，使用兩(liang) 束激光wp 和 wS同時照射樣品。頻率差 Δw = wp − wS(也稱為(wei) 拉曼頻移(Raman shift))與(yu) 特定的分子振動頻率Ω匹配時，拉曼信號憑借受激激發被放大。因此，斯托克斯光束的強度獲得增益放大ΔIS(稱為(wei) 受激拉曼增益(stimulated Raman gain, SRG))，泵浦光束強度減小ΔIp(稱為(wei) 受激拉曼損耗(stimulated Raman loss, SRL))。當Δw不匹配任何振動頻率時，不存在SRL和SRG，因此，不同於(yu) CARS，SRS沒有非共振背景噪聲。
當前不足：
用於(yu) 生物成像無標記成像時，自發拉曼散射靈敏度低，相幹反斯托克斯拉曼散射有背景噪聲。當前的SRS已經被用於(yu) 作為(wei) 一種對比度機製，但是生成的SRS信號有過高的峰值功率，用於(yu) 生物樣品成像會(hui) 造成光損傷(shang) ，且其重複頻率低使得成像速度也不高。
文章創新點：
基於(yu) 此，美國哈佛大學的Christian W. Freudiger(第一作者)和X. Sunney Xie(通訊作者)等人提出一種基於(yu) 受激拉曼散射的三維多光子振動成像技術，可以利用生物的內(nei) 源性對比度介質，進行無標記生物醫學成像。
原理解析：
（1）高重複頻率皮秒激光生成泵浦光和斯托克斯光。使用76MHz重複頻率，7ps脈寬鎖模Nd:YVO4振蕩器同時生成1064nm斯托克斯光束和532nm光束。532nm光束經過可調諧光學參量振蕩器(optical parametric oscillator,OPO)生成所需泵浦光束(見圖1D和圖2)。
（2）高頻相位敏感(phase sensitive)檢測機製提取信號。由於(yu) 在(1)的激發條件下所獲得的SRL和SRG信號被掩埋在激光噪聲裏(ΔIp/Ip 和 ΔIS/IS < 10−4)，激光噪聲主要在低頻部分。對於(yu) SRL，以1.7MHz的頻率調製斯托克斯光束的強度，並使用鎖相放大器以相同的頻率檢測由此產(chan) 生的泵浦光束的強度調製(見圖1C)。類似地，SRG可以通過調製泵浦光束，檢測斯托克斯光束來測量。使用此方法可以檢測ΔIp/Ip 和 ΔIS/IS的強度變化，靈敏度比之前報道的要高四個(ge) 數量級。
（3）SRL在Ip和IS中都是線性的。SRL對分析物濃度的線性依賴(見圖1E)使得直接進行定量分析是可行。圖 1F 中顯示了反式視黃醇(trans-retinol)的孤立拉曼峰的SRL、自發拉曼和 CARS 光譜。盡管 SRL 和自發拉曼光譜幾乎相同，但 CARS 光譜表現出與(yu) 拉曼頻移無關(guan) 的非共振背景，以及由於(yu) 背景幹擾導致的光譜失真。對於(yu) 具有多個(ge) 峰的光譜，也可以看到 SRL、SRG 和自發拉曼光譜之間的良好一致性（圖 1G）。
視頻1：使用 SRL 顯微鏡獲取的小鼠腦部三維圖像堆棧。CH2提供對比度突出了神經元周圍的髓鞘。SRL 顯微鏡的三維切片能力是顯而易見的。
視頻2：使用 SRL 顯微鏡獲取的小鼠腦部三維圖像堆棧。CH2提供對比度突出了富含脂質的結構：角質層的細胞間隙、活性表皮中的毛囊和真皮中的皮脂腺（所提結構按視頻時間順序出現）。
視頻3：使用同時雙色 SRL 顯微鏡所獲得的小鼠皮膚三維圖像堆棧。將二甲基亞(ya) 碸(DMSO) 国产成人在线观看免费网站於(yu) 皮膚，通過調諧到 670cm-1 峰（綠色通道）獲得對比度。從(cong) 2845 cm-1 峰（紅色通道）獲得內(nei) 源性脂質對比度。視頻覆蓋距離表麵約 80 μm 的深度，並顯示 DMSO 通過親(qin) 水途徑滲透。
參考文獻：Freudiger CW, Min W, Saar BG, Lu SJ, Holtom GR et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science 2008; 322: 1857–1861.
DOI：https://doi.org/10.1126/science.1165758
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