單分子顯微鏡極大地擴展了我們(men) 對細胞環境中蛋白質複合物的結構組織、功能構象(functional conformations)和動力學的了解。近來的研究在提高其空間分辨率 、穿透深度、活細胞成像能力和單分子成像方法上取得了顯著進展。
用於(yu) 亞(ya) 納米聚焦和單分子成像的激光直寫(xie)
技術背景：
單分子顯微鏡極大地擴展了我們(men) 對細胞環境中蛋白質複合物的結構組織、功能構象(functional conformations)和動力學的了解。近來的研究在提高其空間分辨率 、穿透深度、活細胞成像能力和單分子成像方法上取得了顯著進展。
具有高空間分辨率的單分子成像方法都采用軸向聚焦鎖定(如全內(nei) 反射模式的紅外激光)和橫向校正方法(如熒光標記)的組合。以高準確度(~1nm)執行的實時三維聚焦鎖定將來自單個(ge) 熒光事件的光子收集z大化，並且與(yu) 沒有主動穩定的標準方法相比，定位精度提高了>10 倍。不準確或緩慢的主動校正會(hui) 導致漂移，降低定位精度並顯著降低原位分辨率(即使在過濾或分組等分析後處理之後也是如此)。
通過結合光學捕獲和優(you) 化單個(ge) 發射器的x/y位置和寬度 (z)，已將具有納米精度的實時聚焦鎖定国产成人在线观看免费网站於(yu) 體(ti) 外樣品。與(yu) 細胞成像兼容的新發展依賴於(yu) 基準點(fiducial)的隨機沉積(deposition)或明場圖像中樣品本身的透射輪廓。然而，當在距離蓋玻片>5µm的深度進行成像時，這些方法在商用軸向聚焦鎖定(通常具有約20nm精度，即Nikon Perfect Focus)上都沒有顯示出明顯的改善，且橫向補償(chang) 有限(如果有的話)。因此，盡管熒光成像技術有望實現高定位精度並增加穿透深度，但它們(men) 對三維成像的一般適應性仍然有限。因此，非常需要一種具有活細胞兼容性、跨微米範圍的絕對三維定位以及精度優(you) 於(yu) 任何先前報道的單分子方法的photon-limited定位精度的聚焦方法。
基於(yu) 此，澳大利亞(ya) 新南威爾士大學的Simao Coelho(一作兼通訊)通過使用雙光子激光直寫(xie) 來控製樣品中基準點的位置和三維結構來解決(jue) 這些聚焦限製，從(cong) 而在細胞體(ti) 積的所有維度上實現實時亞(ya) 納米聚焦(<0.8nm)。並通過整個(ge) 細胞體(ti) 積內(nei) 的三維單分子采集和以納米精度進行活細胞單粒子追蹤證明方法的有效性。
圖 1：基準製造和三維聚焦鎖定示意。a.雙光子激光直寫(xie) 。NIR飛秒激光用於(yu) 觸發引起光敏材料聚合的化學反應。非線性激發固化焦點處的光敏樹脂，而其它區域不受影響。b.三維聚焦鎖定。在明場照明下，基準點產(chan) 生幹涉圖案(下)，該幹涉圖案被獨立的相機以高幀率記錄。衍射圖案的變化用於(yu) 監測樣品所經曆的運動。
實驗結果：
圖2：用於(yu) 3D dSTORM成像、無監督數據采集和活細胞單分子跟蹤的定製基準
實時亞(ya) 納米聚焦和動態聚焦
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