神經元細胞興(xing) 奮的時候，會(hui) 產(chan) 生一個(ge) 電衝(chong) 動，使得鈣離子流入該細胞，促使該細胞分泌神經遞質，下一級神經元就接收到上一級神經元的信號。 鈣成像借助於(yu) 鈣離子熒光指示劑，將神經元中鈣離子濃度的變化反映在熒光強度的變化上，從(cong) 而可以推測神經元的活動（當前鈣成像常用的手段是雙光子顯微成像手段）。準確神經元提取和尖峰推斷（spike inference）是進行進一步分析的前提，這需要高信噪比鈣成像。然而，由於(yu) 體(ti) 內(nei) 鈣瞬變(calcium transients)的低峰值積累和快速動態變化導致熒光光子的缺乏，使得鈣成像容易受到噪聲汙染（即光子散粒噪聲和電子噪聲）的影響。
獲得高信噪比鈣成像最直接的方法是提高激發光強度， 但其導致的光漂白、光毒性和組織加熱對樣品健康和光敏生物過程不利。更有效的策略包括使用更亮的鈣指示劑和更先進的光電檢測技術 ，但在光子受限的條件下，它們(men) 的性能仍然不足（例如樹突成像和深部組織成像）。除了這些物理或生物方法之外，由數據驅動的深度學習(xi) 方法可以降低光子數要求，並在熒光成像中展現出了良好的性能。
2021 Nature Methods:使用深度自監督去噪加強鈣成像中的神經元提取和尖峰推斷
技術背景：
神經元細胞興(xing) 奮的時候，會(hui) 產(chan) 生一個(ge) 電衝(chong) 動，使得鈣離子流入該細胞，促使該細胞分泌神經遞質，下一級神經元就接收到上一級神經元的信號。 鈣成像借助於(yu) 鈣離子熒光指示劑，將神經元中鈣離子濃度的變化反映在熒光強度的變化上，從(cong) 而可以推測神經元的活動（當前鈣成像常用的手段是雙光子顯微成像手段）。準確神經元提取和尖峰推斷（spike inference）是進行進一步分析的前提，這需要高信噪比鈣成像。然而，由於(yu) 體(ti) 內(nei) 鈣瞬變(calcium transients)的低峰值積累和快速動態變化導致熒光光子的缺乏，使得鈣成像容易受到噪聲汙染（即光子散粒噪聲和電子噪聲）的影響。
獲得高信噪比鈣成像最直接的方法是提高激發光強度， 但其導致的光漂白、光毒性和組織加熱對樣品健康和光敏生物過程不利。更有效的策略包括使用更亮的鈣指示劑和更先進的光電檢測技術 ，但在光子受限的條件下，它們(men) 的性能仍然不足（例如樹突成像和深部組織成像）。除了這些物理或生物方法之外，由數據驅動的深度學習(xi) 方法可以降低光子數要求，並在熒光成像中展現出了良好的性能。
當前不足：
然而，鈣瞬變構成的高動態變化、非重複的活動，以及放電模式不能被第二次捕捉等特性，使得以前通過延長積分時間或平均多個(ge) 噪聲幀來獲得訓練用ground truth的方案不再可行。因此，傳(chuan) 統的監督學習(xi) 方法不再有效。
文章創新點：
基於(yu) 此，清華大學的Xinyang Li(第一作者)和Qionghai Dai(通訊作者)提出了一種用於(yu) 鈣成像數據去噪的自監督學習(xi) 方法，命名為(wei) DeepCAD，可實現十倍以上的信噪比提高，而無需任何高信噪比ground truth進行訓練。
（1）直接使用噪聲圖像重建高信噪比的圖像。
（2）模型輸入輸出均為(wei) 三維（(x,y,t)格式)數據，可以充分利用延時堆棧中的時空信息。
原理解析：
所提自監督策略的底層機製是，使用噪聲目標圖像進行訓練，生成噪聲梯度。因為(wei) 整個(ge) 訓練集的平均梯度近似等於(yu) 真實梯度，所以訓練的結果不會(hui) 受無高信噪比ground truth的影響。
(1)基本流程，原始低信噪比堆棧(stack)中的連續幀被分成兩(liang) 個(ge) 子堆棧，分別作為(wei) 輸入和目標來訓練深度神經網絡，網絡選用3D U-Net架構。 訓練後，可以建立去噪模型並記憶網絡參數。 見圖1a，比例尺，50 μm。模型建立後，將三維數據輸入網絡，獲得高信噪比的三維數據輸出。見圖1b。圖1c-g為(wei) 網絡性能驗證實驗。
（2）所用3D U-net網絡架構。如圖2所示，它由一個(ge) 3D 編碼器模塊、一個(ge) 3D 解碼器模塊和三個(ge) 從(cong) 編碼器模塊到解碼器模塊的跳躍連接組成。在編碼器模塊中，有三個(ge) 編碼器塊。每個(ge) 塊由兩(liang) 個(ge) 3 × 3 × 3 卷積層組成，後跟一個(ge) LeakyReLU、一個(ge) 組歸一化層（group nomalization layer）、一個(ge) 在三個(ge) 維度上步長都為(wei) 2的2 × 2 × 2 最大池化層。在解碼器模塊中，有三個(ge) 解碼器塊，每個(ge) 塊包含兩(liang) 個(ge) 3 × 3 × 3 卷積層，後跟一個(ge) LeakyReLU、一個(ge) 組歸一化層和一個(ge) 3D 最近鄰插值層。跳躍連接可以將特征圖從(cong) 編碼器模塊傳(chuan) 遞到解碼器模塊，以集成低級特征和高級特征。編碼器模塊和解碼器模塊的特征圖以不同的顏色表示。所有操作都是 3D 的，特征圖都是 4D 張量。
（3）數據處理流程。網絡訓練如圖3a，成像係統捕獲的原始數據以 3D (x, y, t) 形式組織並保存為(wei) 時間堆棧。原始的噪聲堆棧被劃分為(wei) 數千個(ge) 3D 子堆棧（64×64×600 像素），每個(ge) 維度大約有 25% 的重疊。對於(yu) 橫向尺寸較小或記錄周期較短的時間堆棧，可以從(cong) 原始堆棧中隨機裁剪子堆棧以擴充訓練集。然後，提取每個(ge) 子堆棧的交錯幀（interlaced frames）以形成兩(liang) 個(ge) 3D 圖塊（64 × 64 × 300 像素）。其中一個(ge) 作為(wei) 輸入，另一個(ge) 作為(wei) 網絡訓練的目標，用於(yu) 訓練網絡。預訓練模型的部署如圖3b，成像係統獲得的新數據被劃分為(wei) 3D 子堆棧（64 × 64 × 300 像素），每個(ge) 維度有 25% 的重疊。然後，將預訓練的模型加載到內(nei) 存中，並將子堆棧直接輸入到模型中。增強的子堆棧從(cong) 網絡中依次輸出，並從(cong) 輸出子堆棧中減去重疊區域（橫向和時間重疊）。通過拚接所有子堆棧可以獲得最終的增強堆棧。
（4）實驗采集係統見圖4，用於(yu) 同時采集高信噪比和低信噪比鈣成像數據。Ti:sapp：波長可調的鈦藍寶石激光器；HWP：半波片；EOM：電光調製器；M1：反射鏡；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9：透鏡；scanner：振鏡共振掃描儀(yi) ；DM：長通二向色鏡，用於(yu) 將熒光信號（綠色路徑）與(yu) 激發光（紅色路徑）分開；BS：1:9（反射率：透射率）非偏振分束鏡；PMT1、PMT2：光電倍增管。熒光信號分為(wei) 低信噪比 (~10%) 分量和高信噪比 (~90%) 分量，並由兩(liang) 個(ge) PMT 同步檢測。
視頻1：DeepCAD 在單神經元記錄上的去噪性能。視頻上部為(wei) 神經元的同步電生理記錄，反映了真實的神經活動。檢測到的尖峰用黑點標記。原始噪聲數據和 DeepCAD 增強數據分別顯示在視頻中部和下部。
視頻2：從(cong) 左到右分別是大型神經元群（第 2/3 層，GCaMP6f）的自發鈣瞬變的低信噪比記錄、DeepCAD 增強對應和相應的高信噪比記錄。底部顯示了局部區域的放大視圖。
視頻3：相同的預訓練模型用於(yu) 跨係統的數據去噪仍然有效。視頻中數據來源於(yu) 三個(ge) 不同係統設置的雙光子激光掃描顯微鏡。
參考文獻：Li, X., Zhang, G., Wu, J. et al. Reinforcing neuron extraction and spike inference in calcium imaging using deep self-supervised denoising. Nat Methods (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41592-021-01225-0
文章創意來源文獻：Lehtinen, J. et al. Noise2Noise: learning image restoration without clean data. in Proc. 35th International Conference on Machine Learning (eds Dy, J. & Krause, A.) 2965–2974 (PMLR, 2018).
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