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靈活的同時介觀尺度高速神經活動雙光子成像

發布時間：2022-04-14 14:46:54 瀏覽量：3617 作者：LY.Young 光學前沿

摘要

為(wei) 了了解大腦作為(wei) 一個(ge) 整體(ti) 如何處理信息和執行行為(wei) ，有必要以細胞級分辨率監測整個(ge) 大腦的神經元活動模式。具有鈣指示劑的雙光子顯微鏡已成為(wei) 神經科學中用於(yu) 對清醒行為(wei) 動物的神經元群進行功能性在體(ti) 成像的標準工具。最近，新的雙光子顯微鏡的發展使得能夠對大腦不同區域中越來越多的神經元進行成像。這是通過定製光學元件的設計和製造實現的，這些元件支持在數毫米的視野範圍內(nei) 成像，同時保持細胞級分辨率。然而，當前使用單焦點激發的掃描策略需要在成像區域的數量和整體(ti) 采集速率之間進行權衡。高達~10Hz的總幀速率已經能夠實現，但是這個(ge) 幀率限製了可以研究的神經元動力學類型。像掃動(whisking)、嗅探(sniffing)、眼球運動(eye movements)和運動(locomotion)這樣的感覺運動(sensorimotor)行為(wei) 與(yu) 持續的神經活動關(guan) 聯，並以4-12Hz的數量級激發。鈣瞬變的解卷積可以將尖峰(spike)事件的時間精度提高到<100毫秒。因此，要將這些估計的尖峰與(yu) 行為(wei) 聯係起來，采樣率需要處於(yu) 足夠的奈奎斯特頻率(>30 Hz)。使用多焦點激發的並行掃描可以在高掃描速度下實現真正的同時多區域成像。目前，大視場多焦點雙光子顯微鏡通常設計為(wei) 具有固定光束分布，以匹配空間排列的檢測方案。這限製了用戶在整個(ge) 視場中檢測特定感興(xing) 趣的神經元群的能力，並限製了由於(yu) 光散射的空間串擾而在增加的深度上解析熒光的能力。

正文


靈活的同時介觀尺度高速神經活動雙光子成像


技術背景：

為(wei) 了了解大腦作為(wei) 一個(ge) 整體(ti) 如何處理信息和執行行為(wei) ，有必要以細胞級分辨率監測整個(ge) 大腦的神經元活動模式。具有鈣指示劑的雙光子顯微鏡已成為(wei) 神經科學中用於(yu) 對清醒行為(wei) 動物的神經元群進行功能性在體(ti) 成像的標準工具。最近，新的雙光子顯微鏡的發展使得能夠對大腦不同區域中越來越多的神經元進行成像。這是通過定製光學元件的設計和製造實現的，這些元件支持在數毫米的視野範圍內(nei) 成像，同時保持細胞級分辨率。然而，當前使用單焦點激發的掃描策略需要在成像區域的數量和整體(ti) 采集速率之間進行權衡。高達~10Hz的總幀速率已經能夠實現，但是這個(ge) 幀率限製了可以研究的神經元動力學類型。像掃動(whisking)、嗅探(sniffing)、眼球運動(eye movements)和運動(locomotion)這樣的感覺運動(sensorimotor)行為(wei) 與(yu) 持續的神經活動關(guan) 聯，並以4-12Hz的數量級激發。鈣瞬變的解卷積可以將尖峰(spike)事件的時間精度提高到<100毫秒。因此，要將這些估計的尖峰與(yu) 行為(wei) 聯係起來，采樣率需要處於(yu) 足夠的奈奎斯特頻率(>30 Hz)。使用多焦點激發的並行掃描可以在高掃描速度下實現真正的同時多區域成像。目前，大視場多焦點雙光子顯微鏡通常設計為(wei) 具有固定光束分布，以匹配空間排列的檢測方案。這限製了用戶在整個(ge) 視場中檢測特定感興(xing) 趣的神經元群的能力，並限製了由於(yu) 光散射的空間串擾而在增加的深度上解析熒光的能力。


技術要點：
基於此，美國波士頓大學的Mitchell Clough(一作)和Jerry L. Chen(通訊)提出了一種四區域大視場雙光子顯微鏡(quad-area large FOV two-photon microscope, Quadroscope)，能夠在橫跨約5mm的總視場上實現四個可獨立靶向大腦區域的視場同時視頻幀率細胞級分辨率成像。作者展示了其在行為相關時間尺度上測量小鼠感覺運動皮層鈣活性的能力。
(1) 使用兩個獨立掃描引擎實現跨大視場同時成像，兩個掃描引擎使用相似的物鏡和相似的光學組件，結合自適應光學實現雙區域成像的分辨率增強。
(2) 引入基於焦平麵單元(focal plane units, FPU)的光束組合，實現成像視場數的增加。



a、Quadroscope係統。激光源由flip mounted mirror(FM)選擇。激光輸出隨後被50/50分束鏡分成四束(光束1-紅色，2-橙色，3-綠色，4-藍色)。每一束光相對於另一束延遲8ns，經過擴束鏡(BE)後進入焦平麵單元(focal plane units, FPUs)。1/2波片結合偏振分光鏡(PBS)實現每束光能量的控製。兩個掃描引擎各自控製兩個成像預取。每一個掃描引擎由三個商業掃描鏡頭(SL1-3)、一個共振掃描儀(resonance scanner)、一個二維掃描反射鏡、一個定製的掃描鏡頭(SL4)至於合束PBS之前組成。合束的光進入一個定製的tube lens，隨後進入定製的物鏡(OBJ)。一個長通二向色鏡(IR/VIS dichroic)用於分離激發光和發射光。b、FPU設計。每一個FPU安裝在一個機械XY位移台上，包含一個電動可調鏡頭(electrically tunable lens, ETL)和一個中繼鏡頭。c、掃描區域定位示意圖。四個子區的每一個能掃描的區域達~0.75平方毫米。每一個掃描臂有3mm的臂視場，在這個臂視場範圍內，可以使用FPU來重新定位子區域。臂視場可以用二維掃描反射鏡在4.8mm的總視場內任意定位。d、覆蓋在小鼠皮層圖譜上的掃描區域和視場。e、四波束的時空複用。一個31.25MHz的激光源被分成四束並實現8ns脈衝間隔延遲。探測到的熒光信號隨後被解複用並分配到每個成像區域。


實驗結果：

使用1040nm激光源對清醒小鼠感覺運動皮層中 jYCaMP1s的四區雙光子鈣成像


附錄：


Quadroscope係統機械設計


定製掃描鏡頭和tube lens說明


探測係統的光學設計和分析


參考文獻：Clough, M., Chen, I.A., Park, SW. et al. Flexible simultaneous mesoscale two-photon imaging of neural activity at high speeds. Nat Commun 12, 6638 (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26737-3


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