相幹拉曼顯微鏡係統的大部分成本和複雜性在於(yu) 激光激發。必須利用兩(liang) 個(ge) 激光波長，對絕對波長進行一定控製，並對頻率差進行精確控製，使其在單個(ge) 拉曼線(10 cm−1)的寬度內(nei) 。
光源對相幹拉曼顯微鏡係統性能的影響
曆史上，第①個(ge) 相幹拉曼顯微鏡使用了光譜可見區域的脈衝(chong) 染料激光器。近來的係統已經使用了固體(ti) 激光器係統，或基於(yu) 電子同步鈦藍寶石激光器或同步泵浦光學參數振蕩器(opo)的鎖模激光器。新一代基於(yu) 光纖的係統，無論是基於(yu) 光子晶體(ti) 光纖或有源光纖激光器中的非線性頻率轉換，都承諾提高易用性和更低的成本，但目前使用這些係統需要在性能上進行權衡。
相幹拉曼顯微鏡的激發需要(至少)兩(liang) 個(ge) 激光波長，其中一個(ge) 波長必須是可調的，以匹配分子振動頻率的差頻。此外已經證明，用幾皮秒的激光脈衝(chong) 寬度激發CARS和SRS可以理想地平衡高效生成非線性信號所需的高峰值功率與(yu) 相對狹窄的光譜帶寬(<1 nm)的要求，以匹配分子振動的固有線寬。對於(yu) 高速成像，至少需要10 Mhz的重複頻率，理想情況下應該更高。這是因為(wei) 在視頻速率成像中，數據是以每秒1000萬(wan) 像素的速度獲取的，並且CARS至少需要每個(ge) 像素發射一個(ge) 激光(對於(yu) 帶有調製傳(chuan) 輸檢測的SRS至少需要兩(liang) 個(ge) 激光)。此外，近紅外光譜區域的激光激發已被證明能較大限度地減少CARS中非共振背景的產(chan) 生，與(yu) 可見光激發相比，提供了減少的光損傷(shang) ，也為(wei) 非線性顯微鏡提供了良好的穿透組織的能力。Z後，由於(yu) CARS或SRS顯微鏡中的光激發路徑通常具有相對較低的透射率(從(cong) 激光輸出到樣品通常觀察到10%-20%)，因此需要瓦級平均功率。
許多研究小組發表的論文報道了使用50 - 200 fs脈衝(chong) 寬度而不是2 - 6 ps脈衝(chong) 。雖然CRS過程可能由飛秒脈衝(chong) 激發，但這是以降低信號水平、限製可調諧性、損失光譜選擇性和增加CARS中的非共振背景為(wei) 代價(jia) 的。這主要有兩(liang) 個(ge) 原因。首先，典型的拉曼光譜特征寬度約為(wei) 15 cm−1。在800nm附近，這相當於(yu) 約1 nm的帶寬。對於(yu) 任何激光器係統，激光脈衝(chong) 寬度和激光光譜帶寬之間的反比關(guan) 係意味著，對於(yu) 給定的光譜帶寬，可以達到的Z短脈衝(chong) 有一個(ge) 基本的限製。在1 nm帶寬的情況下，假設脈衝(chong) 形狀為(wei) 高斯，該脈衝(chong) 寬度約為(wei) 0.95 ps。將脈衝(chong) 縮短到這個(ge) 值以下將導致CARS中非共振背景/共振信號比的增加，從(cong) 而降低對比度和降低圖像質量。
在SRS中，結果很簡單，即使峰值功率(因此非線性光損傷(shang) )會(hui) 增加，也不會(hui) 產(chan) 生額外的信號，因為(wei) 與(yu) 拉曼有源躍遷沒有共振的頻率分量不會(hui) 產(chan) 生信號。此外，如果附近發生兩(liang) 個(ge) 共振，較寬的帶寬將意味著光譜分辨率較低，獲得的圖像將受到兩(liang) 個(ge) 共振信號的汙染。對於(yu) 用於(yu) 多光子顯微鏡的商用鎖模飛秒鈦藍寶石激光器獲得的典型8 nm帶寬，這意味著隻有大約1/8的激光能量国产成人在线观看免费网站於(yu) 樣品被CRS過程有效利用。相比之下，對於(yu) 幾皮秒的脈衝(chong) ，所有的激光強度都集中在與(yu) 拉曼共振完全匹配的較窄頻段，可以很好地分辨。雖然寬帶飛秒激光器的光譜分辨探測可以以高分辨率恢複CARS或SRS光譜，但它通常需要ccd相機等多元素探測器，每個(ge) 像素的讀出時間非常長，這嚴(yan) 重限製了成像速度。
脈衝(chong) 長度稍長、平均功率較高但峰值功率降低的第②個(ge) 特征是非線性光損傷(shang) 降低。這實際上是有好處，通過激發6 ps脈衝(chong) 比150 fs脈衝(chong) 允許更多的總SRS信號，即使在廣泛共振的情況下。其原因是，在許多樣品中，隨著激光脈衝(chong) 寬度的減小，非線性光損傷(shang) 比感興(xing) 趣的信號增加得更快。在使用較短脈衝(chong) 的情況下，光損傷(shang) 顯然會(hui) 比SRS的信號水平上升得更快。當然，實際的縮放和損傷(shang) 閾值高度依賴於(yu) 樣本，因此很難對安全功率水平做出絕對的聲明。
相幹拉曼技術的主要優(you) 勢是成像速度和靈敏度，在1-10 ps範圍內(nei) (相對於(yu) 100-200 fs)的激光脈衝(chong) 的適當選擇是獲得較佳結果的關(guan) 鍵。在這個(ge) 範圍內(nei) ，精確的選擇隻會(hui) 對可獲得的信號產(chan) 生很小的影響(小於(yu) 2倍)，同時保持良好的光譜分辨率。
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