熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)是一種鑒別熒光團獨特分子環境的有力技術。FLIM測量熒光團在發射光子之前處於(yu) 激發態的時間，並檢測熒光團的分子變化，這些變化單獨用光譜技術是看不出來的。FLIM對多種生物醫學過程敏感，包括疾病進展和藥物療效。
熒光的產(chan) 生與(yu) 熒光壽命檢測原理
當處於(yu) 基態的分子(圖1中的S0表示)吸收的光能量等於(yu) 或大於(yu) 較高能級的光(S1;S2;:::;Sn)，電子在短時間內(nei) 被激發到更高的能級。電子將經曆振動弛豫到激發態的最低振動水平(記為(wei) S1)，這是一種稱為(wei) 內(nei) 轉換的非輻射過程。從(cong) S1電子態，分子通過輻射或非輻射過程回到基態。圖1表示了在這些能級中發生的不同發光現象。
熒光是分子(熒光團)通過發射可檢測的光子(時間尺度為(wei) 
)衰減到基態的輻射過程。熒光發射發生在激發電子能級最低的位置(S1)。這種來自最低激發電子能級的強製發射確保了發射光譜保持不變，並且與(yu) 激發波長無關(guan) 。由於(yu) 振動弛豫和內(nei) 部轉換中的能量損失，發射的熒光光子的能量較低(即發射發生在比激發更長的波長)。這種發射波長的位移稱為(wei) 斯托克斯位移。另一個(ge) 主要發光過程，磷光，通過被稱為(wei) 係統間交叉(ISC)的過程發生在激發時電子能量躍遷到三元態能級(T1;T2;:::;Tn)。三重態的電子具有平行自旋，這些電子躍遷是“自旋禁止的”，通過發射一個(ge) 磷光光子或ISC反轉和發射一個(ge) 延遲的熒光光子，導致向地能級的緩慢躍遷。磷光的發生時間從(cong) 毫秒到數百秒不等。圖1所示的Jablonski圖簡潔地說明了這些過程。
圖1
分子的量子產(chan) 率被定義(yi) 為(wei) 發射的光子與(yu) 吸收的光子之比。常見熒光化合物的量子產(chan) 率包括熒光素的80%，eGFP的60%，色氨酸的6%，還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的2%。分子的這種發射效率取決(jue) 於(yu) (1)它相對於(yu) 入射電磁波電場方向的空間方向(極化)，(2)吸收入射光子能量可用的電子能級(吸收光譜)，(3)振動能級重排的效率(熒光壽命)，(4)弛張回到基態電子能級(斯托克斯位移)，(5)基態(發射光譜)內(nei) 振動能級的總體(ti) 。熒光團由吸收光譜、熒光壽命、斯托克斯位移和發射光譜表征。
按照慣例，熒光壽命τ定義(yi) 為(wei) 熒光團處於(yu) 激發態的平均時間。在此區間內(nei) ，強度I（t）減小到1/e或其原始值的36.8%。t時刻的衰變強度由樣本中所有物種i的一級動力學方程求和得到。
其中α是指前因子或指數函數的幅值。多指數混合種的平均壽命(τm)是各種壽命(τi)與(yu) 各種貢獻(αi)的加權之和。
另外，在t時刻被激發的分子數為(wei)
其中n（t）是t時刻處於(yu) 激發態的分子數。
在熒光壽命的檢測中，樣品由一個(ge) 短的激勵脈衝(chong) 激發，衰減由光子到達時間計算，光子被分組成直方圖，或通過時間門控檢測或脈衝(chong) 采樣技術。如果有多個(ge) 熒光種存在，所有的種都被總結為(wei) 一個(ge) 單一的直方圖。在頻域方法中，每個(ge) 光子都用它相對於(yu) 激發光子的相位延遲來表示，這類似於(yu) 到達時間直方圖。對於(yu) 多物種，在傅裏葉空間中分析這種相位分布，提取分離多物種的調製解調參數。時域和頻域都在不同的FLIM場景中提供了獨特的優(you) 勢和挑戰，包括低光子預算成像，高動態範圍成像，或高時間分辨率成像。
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