長期以來，光學顯微鏡的分辨率都被認為(wei) 是有極限的，它不可能超過二分之一個(ge) 光波長度。熒光顯微成像是一類對特定樣本使用熒光蛋白或分子標記後對其標記物成像的光學顯微成像技術。而超分辨率熒光顯微成像係統由於(yu) 其可以實現納米級的成像分辨率，且對樣品破壞性小，可進行三維成像，可進行活體(ti) 樣品觀測等特點，在近十幾年來受到生命科學、顯微成像、計算機等等領域科學家的廣泛關(guan) 注，並促使了一係列適合生物樣品成像的超分辨率成像技術的開發與(yu) 国产成人在线观看免费网站。
超分辨熒光顯微成像技術
單分子定位熒光顯微成像包括光激活定位顯微（PALM）和隨機光學重構顯微（STORM）。兩(liang) 者的原理相似，成像過程均需要往複循環，在每個(ge) 循環周期裏，熒光分子團被連續的激活、成像及漂白。
PALM工作原理
光激活定位顯微技術photoactivated localization microscopy（PALM）其基本原理是首先使用光活化綠色熒光蛋白（PA-GFP）來標記蛋白質，並將較低光功率的405nm 激光照射細胞表麵，用於(yu) 激活稀疏分布的幾個(ge) 熒光分子。之後用561nm激光照射，使已經激活的熒光分子因為(wei) 受激發射而產(chan) 生熒光信號，接著繼續照射使這些發光的熒光分子產(chan) 生漂白， 在下一輪不能被激發光再次激活。之後交替使用405nm和561nm激光來進行激活，激發和漂白其他的熒光分子。往複循環，直至全部完成稀疏標記的細胞成像。圖1展示了使用光激活定位顯微技術PALM 定位單個(ge) 熒光分子最後實現超光學衍射極限分辨率成像的示意圖。PALM的成像方法隻能觀察基於(yu) 細胞外源表達的蛋白質。
圖1.PALM超分辨率顯微成像係統原理及示意圖
PALM超分辨係統係統部分組成及光路結構：
（1）倒置熒光顯微鏡：可以用於(yu) 激光掃描共焦顯微成像或者單分子PALM顯微成像。（2）半導體(ti) 激光：405nm激光器作為(wei) 激活光，561nm激光器作為(wei) 激發光，激光器波長的選擇是要和使用的光活化蛋白的特性有關(guan) ，用於(yu) 激發熒光的激光器波長一般包括488、561、594、635nm。激光器功率一般在50-200mW。為(wei) 了光路調節的方便，一般要求激光器輸出光斑質量要好。（3）自由空間或光纖多波長耦合器：自由空間耦合器可以使得更高功率的激發和激活激光進入顯微鏡係統，使得成像過程可以更快。（4）快門或AOTF(Acousto-Optic Tunable filter聲光可調濾波器)：快門或AOTF的作用是切換激活光和激發光，使得激活光和激發光依次照射在樣品上，實現快速光開關(guan) 的目的。在空間光輸入到顯微鏡之前，使用AOTF可以使得進入顯微鏡的光強最大。（5）激發濾光片、二向色片、長通濾光片：用於(yu) 收集熒光信號最大，同時阻擋激發光，使得保證信噪比，消除殘餘(yu) 光和自發熒光。（6）TIRFM(全內(nei) 反射熒光顯微鏡)物鏡。TIRFM物鏡的作用是使光束在樣品表麵發生全內(nei) 反射，用以提高圖像的信噪比。同時TIRF物鏡的數值孔徑都比較大，會(hui) 有比較好的光子收集效率。（7）emccd或scmos相機。相機要在可見光範圍內(nei) 有較高的量子效率、較高的幀速、較低的噪聲。
圖2. PALM成像效果
蛋白的激活和漂白通常需要多種窄線寬激光器。法國Oxxius激光器生產(chan) 廠商則提供了這樣的合束激光器解決(jue) 方案，專(zhuan) 門為(wei) 生物視覺領域設計。
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