摘要：雙光子成像已經成為(wei) 神經電路光學監測的一種有用的工具，但它需要較高的激光功率和對樣本中每個(ge) 像素的串行掃描。這導致成像速率慢，限製了對神經元活動等快速信號的測量。為(wei) 了提高雙光子成像的速度和信噪比，我們(men) 對雙光子顯微鏡進行了簡單的改進，使用了一個(ge) 衍射光學元件(DOE)，它將激光束分成幾個(ge) 小束，可以同時掃描樣品。我們(men) 通過增強新皮層大腦切片神經元動作電位雙光子鈣成像的速度和靈敏度，證明了DOE掃描的優(you) 勢。DOE掃描可以很容易地提高雙光子和其他非線性顯微技術對時變信號的檢測。
雙光子衍射光學元件成像
摘要：雙光子成像已經成為(wei) 神經電路光學監測的一種有用的工具，但它需要較高的激光功率和對樣本中每個(ge) 像素的串行掃描。這導致成像速率慢，限製了對神經元活動等快速信號的測量。為(wei) 了提高雙光子成像的速度和信噪比，我們(men) 對雙光子顯微鏡進行了簡單的改進，使用了一個(ge) 衍射光學元件(DOE)，它將激光束分成幾個(ge) 小束，可以同時掃描樣品。我們(men) 通過增強新皮層大腦切片神經元動作電位雙光子鈣成像的速度和靈敏度，證明了DOE掃描的優(you) 勢。DOE掃描可以很容易地提高雙光子和其他非線性顯微技術對時變信號的檢測。
我們(men) 將一個(ge) DOE放置在與(yu) 物鏡和檢鏡後孔徑共軛的平麵上(圖1A)。這個(ge) 元件在光程中被望遠鏡跟隨，這是確保從(cong) DOE出現的小束也在檢鏡處重新連接在一起所必需的，允許每個(ge) 單獨的小束保持準直，並微調-小束傳(chuan) 播的角度。當使用偶數量的波束時，我們(men) 通過機械阻塞消除了零級波束。雖然從(cong) DOE發射出的每個(ge) 小束都與(yu) 射入DOE上的激光束的直徑相同，但隨後的望遠鏡產(chan) 生了一個(ge) 副作用，即每個(ge) 小束的大小與(yu) 望遠鏡的功率成正比。因此，我們(men) 用另一台望遠鏡預先縮小或預先擴大入射激光。由於(yu) 我們(men) 的係統已經在光路的早期使用了望遠鏡，使光束通過針孔(一個(ge) 空間濾波器，確保光束截麵輪廓的圓度;圖1B，元素3)，我們(men) 利用同樣的望遠鏡，通過簡單地改變該望遠鏡的焦距和第②個(ge) 透鏡的位置來預補償(chang) 光束的大小(圖1A)。這確保了小波束稍微覆蓋了我們(men) 目標的後光圈。小束撞擊到檢鏡上並被反射的角度決(jue) 定了小束在樣品上的空間擴散，這是我們(men) 實驗中的一個(ge) 關(guan) 鍵變量。這個(ge) 角度由來自DOE的光束間角(由其相位掩模定義(yi) )和DOE與(yu) 振鏡之間的望遠鏡功率控製。
在所有的實驗中，我們(men) 都使用了DOEs，它在一條單線上創建了一係列均勻間隔的波束。這個(ge) DOE很容易繞著光路的軸線旋轉，從(cong) 而沿著任意方向形成一條點線。在快速掃描中，這種旋轉可用於(yu) 調節沿垂直維度的有效波束間角距離。為(wei) 了增加每像素的光子通量，我們(men) 使用了一個(ge) 五束小束DOE [SLH-505X-(0.23)-(780)來自StockerYale]，並將小束水平放置以激發相同的點，或彼此非常接近的點(圖2，頂部)。
在所有使用DOE的實驗中，我們(men) 確保每個(ge) 小束都有足夠的功率，能夠充分激發熒光團。在比較單束和五束成像模式的實驗中，我們(men) 將DOE保留在原位，並在兩(liang) 種實驗中生成5個(ge) 小波束，它的區別是在單束實驗中，我們(men) 簡單地在中間成像平麵放置一個(ge) 簡單的虹膜隔膜，作為(wei) 四個(ge) 小波束路徑上的屏障，隻允許一個(ge) 通過)。在這些條件下，在800 nm處，單個(ge) 中心光束對樣品的功率為(wei) 24 mW，而所有五束光的功率之和對樣品的功率為(wei) 108 mW，其他四束的平均功率為(wei) 21 mW，每個(ge) 都在平均值的5%以內(nei) 。
檢鏡掃描與(yu) 單光束雙光子光柵掃描成像相同，並使用放大光電倍增管(PMT)進行檢測(PMT: H7422-P40 Hamamatsu, Bridgewater, NJ, USA;放大器:信號恢複AMETEK測量技術，沃金厄姆，英國)。PMT從(cong) 來自DOE的多個(ge) 小束同時激發的所有點收集發射光。在這種激勵-促進機製下，波束的水平方向並不是嚴(yan) 格要求的。相對於(yu) 感興(xing) 趣的特征，小的波束間距是關(guan) 鍵，然而水平方向是較直接的国产成人在线观看免费网站。這種成像方式稍微降低了沿小波束方向的成像的空間分辨率，但隨著時間的推移增加了每個(ge) 成像像素的集成強度，因為(wei) 每個(ge) 像素都被采樣了多次，每個(ge) 小波束一次。可以通過旋轉DOE來改變波束的水平或垂直方向，以保持沿某一特定軸的較大分辨率，同時犧牲沿另一軸的分辨率來獲得增加的信號。
我們(men) 探索了DOE在雙光子成像中的国产成人在线观看免费网站，總體(ti) 目標是提高測量的速度和信噪比。我們(men) 利用雙光子成像通常隻使用激光產(chan) 生的一小部分功率來創建多個(ge) 具有足夠雙光子激發的功率的光束，以便更快地激發一個(ge) 完整的成像場並產(chan) 生更好的信噪比。我們(men) 的係統是從(cong) 雙光子顯微鏡的早期版本發展而來的，在該係統中，我們(men) 使用DOE將激光束多重化，將穀氨酸釋放到樣品上(Nikolenko等人，2007年)。我們(men) 的裝置包括一個(ge) 定製的雙光子掃描顯微鏡，飛秒激光作為(wei) 激發源，一個(ge) 傳(chuan) 統的振鏡掃描係統，一個(ge) PMT或ccd相機作為(wei) 探測器(見“材料和方法”部分;我們(men) 測試了幾種線性DOEs，創建了5、11、16和32個(ge) 波束的線性陣列，並探索了兩(liang) 種通用的掃描策略，將波束水平或垂直定位，盡管我們(men) 也探索了中間位置，如下所示(圖2)。實際的掃描掃描總是水平方向，每個(ge) 波束都有足夠的功率誘導樣品的雙光子激發，如果用作單個(ge) 激發源，其本身將允許高質量的成像。在水平DOE模式下，在獲取單個(ge) 幀的過程中，用幾個(ge) 小波束激勵每個(ge) 像素，從(cong) 而有效地增加每個(ge) 像素的雙光子激勵量，隨著時間的推移而集成(圖2，頂部麵板，“激勵增強”)。這樣做的一個(ge) 後果是由於(yu) 空間上更大的激勵譜線，圖像在水平方向上的空間模糊，盡管這可以較小化，空間分辨率提高，用更窄的波束間距。在垂直DOE模式下，可以掃描均勻間隔的一係列波束，這些波束均勻分布在視場的垂直維度上(圖2，底部麵板，“加速”;參見“材料和方法”部分)。因此,在一個(ge) 係統的n光束,每個(ge) 光束必須隻蓋一條領土的全部水平方麵的高度等於(yu) 1 / n總高度存在誤傷(shang) 的觀點,從(cong) 而減少所需的總時間掃描等於(yu) n倍。盡管可以使用PMT或相機在水平能源部模式,垂直能源部模式需要一個(ge) 相機或其他探測器有能力解決(jue) 一些光源的數量大於(yu) 等於(yu) 光束能量來使用。
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