雖然振動光譜是具有化學特異性的光學對比的理想候選者，並提供了熒光標記和染料染色的無標記替代方案，基於(yu) 紅外吸收和自發拉曼散射的顯微鏡分別受到低空間分辨率和本質微弱信號的限製。相幹反斯托克斯拉曼散射(CARS)可以通過提供弱自發拉曼散射信號的相幹信號放大數個(ge) 數量級來克服這些限製。而SRS可以進一步的避免CARS的局限性。
SRS相對於(yu) 自發拉曼與(yu) CARS的優(you) 點
SRS是另一種相幹拉曼散射(CRS)過程，其激發條件與(yu) 共振CARS相同。與(yu) 自發拉曼散射不同，在自發拉曼散射中，樣品被一個(ge) 激發場照亮，SRS中兩(liang) 個(ge) 激發場在泵浦頻率ωp和斯托克斯頻率ωs處重合在樣品上。如果激發束的差頻Δω = ωp−ωs與(yu) 焦點內(nei) 分子的振動頻率Ω相匹配，即分子躍遷由於(yu) 分子躍遷的刺激激發，速率提高。分子居群從(cong) 基態通過虛態轉移到分子的振動激發態(圖1A)。這與(yu) 自發拉曼散射相反，自發拉曼散射從(cong) 虛態到振動激發態的轉變是自發的，導致信號弱得多。
圖1.受激拉曼散射原理(A) SRS的能量圖。泵浦和斯托克斯束的共同作用通過虛態有效地將樣品中的分子從(cong) 基態轉移到第一振動激發態。被激發的振動狀態可以通過調節泵和斯托克斯梁之間的頻率差來選擇。(B) SRS作為(wei) 能量轉移過程。由於(yu) 分子振動的激勵，一個(ge) 泵浦光子被吸收，一個(ge) 斯托克斯光子被產(chan) 生，這分別導致了傳(chuan) 輸泵浦光束和斯托克斯光束的SRL和SRG。
由於(yu) 分子振動的相幹激發(圖1B)，一個(ge) 泵浦光子被樣品吸收，產(chan) 生一個(ge) 斯托克斯光子。這導致傳(chuan) 輸泵浦和斯托克斯光束強度的損耗(受激拉曼損耗，SRL)和增益(受激拉曼增益，SRG)分別為(wei) ΔIp和ΔIS:
其中N為(wei) 探針體(ti) 積中的分子數σ拉曼為(wei) 分子拉曼散射截麵。
在SRS顯微鏡中，我們(men) 測量ΔIp (SRL)或ΔIS (SRG)作為(wei) 樣品位置的函數。因為(wei) ΔI∝N，即信號與(yu) 目標物種的濃度c成正比，現在有可能生成樣品的定量化學圖。不同的化學物質可以根據不同的振動頻率被靶向，如自發拉曼文獻中記錄的ΔI∝σ拉曼。
由於(yu) 信號對激發強度的非線性依賴性，SRS允許與(yu) 雙光子顯微鏡類似的本征光學切片，消除了共聚焦針孔的需要。這對於(yu) 厚組織樣本的成像尤其有用。
表1.自發拉曼散射與(yu) 相幹拉曼散射的比較
| 自發拉曼散射 | SRS |
| 單光子過程 | 多光子過程 |
| 極慢成像(>20分鍾/幀) | 快速成像，可達(30 fps) |
| 無固有z分辨率 | 光學切片 |
| 可見光/紫外光束激發增強散射 | 激發與近紅外光束增強成像深度 |
| 易受背景熒光影響 | 對背景熒光免疫 |
| 全光譜 | 選定的光譜信息 |
表2. CARS和SRS的比較
| CARS | SRS |
| 參數化過程 | 能量傳遞過程 |
| 新光頻信號 | 透射激勵光束的強度增益和損耗 |
| 非特定的非共振背景 | 無非共振背景 |
| 扭曲的光譜 | 與自發拉曼光譜相同 |
| 相幹圖像偽影 | 信號是物體與點擴散函數的卷積 |
| 非線性濃度依賴性 | 線性濃度依賴性 |
CARS的產(chan) 生條件與(yu) SRS相同，但檢測方法不同。在SRS中，可以檢測到激勵束的強度增益和強度損失，而在CARS，反斯托克斯頻率下的新輻射ωaS = 2ωp−ωS 。CARS是由被稱為(wei) 四波混合的光學參量過程產(chan) 生的，在這個(ge) 過程中能量在光場之間交換。這與(yu) SRS相反，SRS是光場和樣品之間的能量傳(chuan) 遞過程。這解釋了為(wei) 什麽(me) 如果Δω不匹配樣品的振動頻率，因此不受非共振背景的影響，SRS不能發生，因為(wei) 樣品沒有吸收量子振動能量的本征態。
盡管與(yu) 自發拉曼散射顯微鏡相比，CARS在成像速度上有很大的優(you) 勢，但在生物醫學研究中尚未被廣泛接受。與(yu) 其他顯微鏡技術相比，CARS由於(yu) 樣品的電子響應和相幹信號相加引起的非共振背景信號的困難而不能直接解釋圖像。CARS顯微鏡的特定限製是：空間幹擾造成的圖像失真•光譜幹擾造成的光譜失真•信號對目標物種濃度的非線性依賴•靈敏度有限(弱共振信號被埋在與(yu) 非共振背景相關(guan) 的激光噪聲中。
綜上所述，與(yu) 自發拉曼散射相比，SRS具有相幹拉曼散射技術的所有優(you) 點(見表1)，但克服了CARS顯微鏡的局限性(見表2)。
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