移動一個(ge) 緊密聚焦的激光光斑在樣品上，逐點記錄信號，以便在計算機重建。由於(yu) 相幹拉曼散射技術在入射光強方麵是非線性的，將所有的激光能量壓縮成一個(ge) 光斑，並在樣品上方高速移動該光斑，將使CARS或SRS信號在給定的總平均功率下被国产成人在线观看免费网站到樣品上。此外，掃描可以很容易地利用相幹拉曼散射固有的光學切片能力，因為(wei) 信號隻在聚焦尤為(wei) 緊密的部分產(chan) 生。
相幹拉曼技術中常用的掃描方案
掃描有兩(liang) 種常用的方法:樣品掃描和光束掃描。樣品掃描提供了一個(ge) 簡單的設備，但通常較低的速度和較小的視野，而光束掃描更複雜的實現，對光學係統的性能要求更高，但提供了更大的視野和更高的成像速度。
在樣品掃描中，整個(ge) 相幹拉曼光學設置是固定的，樣品相對於(yu) 焦點平移。這意味著光學係統可以對準一個(ge) 固定的激光束，這比在一係列可能的激光束位置上對準係統更容易。為(wei) 了獲得高的空間分辨率，需要一個(ge) 平移階段具有較高的精度和重複性要求。通常，采用壓電驅動的彎曲級。這些階段提供的步長和重複性遠遠超過光學顯微鏡(通常小於(yu) 5 nm)和較大數百微米的平移所要求的。這種製度主要有兩(liang) 個(ge) 缺點:一是圖像的較大視場是由舞台的較大行程決(jue) 定的，而不是光學。因此，切換到倍率較低的鏡頭並不能提供大的視野。通常情況下，使用10倍倍率物鏡的光學顯微鏡可以獲得>1毫米的視野，但使用壓電台則無法獲得這些視野。二是這些級的機械共振頻率通常將較大掃描速度限製在每行至少數十毫秒(或更高)，這意味著它們(men) 至少比波束掃描係統慢一個(ge) 數量級。
盡管有這些限製，樣本掃描的簡單性使它在許多情況下成為(wei) 一個(ge) 可行的選擇。樣品掃描係統的光學吞吐量也非常高，因為(wei) 需要的光學是物鏡。當發射束被進一步分析時，樣品掃描也會(hui) 有好處，例如，通過光譜儀(yi) ，在光譜儀(yi) 中，光束的移動會(hui) 造成偽(wei) 影。
另外也可以通過掃描樣品上的組合激光焦點並記錄CARS或SRS信號作為(wei) 位置的函數來形成圖像。激光掃描是通過一對通過線圈的電流產(chan) 生角度偏轉的振鏡來完成的。普通非諧振振鏡的掃描線率高達~ 1khz，而諧振振鏡的掃描線率高達~ 8khz。行率除以每個(ge) 圖像的行數(通常為(wei) 512)決(jue) 定了成像係統的幀率。行周期(行速率的倒數)除以每行像素數(通常是512)決(jue) 定了掃描係統中的像素停留時間。對於(yu) 一個(ge) 普通的非諧振振鏡，成像速度為(wei) 每秒2幀，像素停留時間為(wei) 2 μs是可能的。
圖1.激光掃描顯微鏡的光路示意圖。給出了奧林巴斯係統的近似焦距(FL)。通過顯微鏡的光束路徑顯示了鏡鏡的兩(liang) 個(ge) 位置。黑色鏡麵對應著穿過光學係統中心的紅色通道。灰色鏡麵對應著穿過光學係統邊緣的橙色路徑。掃描透鏡/管透鏡係統有雙重用途:放大輸入激光束以匹配物鏡後孔徑，並將掃描鏡位置成像到後孔徑上，以避免光束夾擊。盡管這張圖隻顯示了一維掃描，但可以使用靠近第①個(ge) 掃描鏡的第②個(ge) 掃描鏡來掃描正交軸，或者可以在這裏所示的配置中使用一個(ge) 兩(liang) 軸掃描鏡。雖然這裏顯示的是簡單的單線態透鏡，但一個(ge) 真正的掃描光學係統是由多元件透鏡組成的，以獲得色差校正和一個(ge) 平坦的掃描場。
掃描係統由掃描鏡、一對中繼透鏡和物鏡組成。中繼透鏡，被稱為(wei) 掃描透鏡和管透鏡(按光束傳(chuan) 播順序)，其目的是在顯微鏡物鏡的後孔徑上產(chan) 生掃描鏡的放大圖像。這是必要的，因為(wei) 在焦平麵上對焦斑的掃描是通過掃描激光束在後孔徑上的入射角度來完成的，激光光斑在該位置的運動是較小的。由於(yu) 光束夾持(稱為(wei) “暈光”)，在物鏡背麵孔徑上激光光斑的運動將產(chan) 生不均勻的照明強度。此外，利用這兩(liang) 個(ge) 透鏡組合的放大倍率來增加入射光束的直徑，該直徑必須小於(yu) 4毫米，但應該足夠大，以填補物鏡後孔徑(~ 5-10毫米)，以實現緊密聚焦。圖1為(wei) 兩(liang) 種不同掃描鏡位置的激光掃描顯微鏡內(nei) 部光路，用不同顏色表示。管透鏡和掃描透鏡係統的成像作用是明確的，因為(wei) 兩(liang) 個(ge) 掃描鏡角度的光束都擊中相同的位置，和放大作用表現為(wei) 光束尺寸的變化。掃描通常在計算機控製下完成，掃描控製器計算機還記錄像素強度隨時間的變化，以便在屏幕上繪製圖像。
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