拉曼光譜的主要優(you) 點之一是其自發性質，可以對生物樣品進行無標簽光譜分析。然而，自發拉曼隻發生在大約1 / 108的入射光子中，這嚴(yan) 重限製了信號的強度。許多生物樣品在可見範圍內(nei) 發出熒光，這可能會(hui) 壓倒拉曼信號，這進一步加劇了這一事實。
拉曼光譜成像模式的優(you) 化方法
為(wei) 了減少來自熒光對拉曼信號的影響，人們(men) 可以使用長波長激光，但是相應的拉曼信號會(hui) 有所降低。目前，大多數拉曼成像是在700到900納米之間進行的，在這個(ge) 範圍內(nei) ，可以發現自發熒光和拉曼信號之間的妥協。即便如此，需要很長的采集時間來檢測足夠的光子，並獲得可接受的信號噪聲。在快速係統中，獲取足夠的光子來測量單個(ge) 拉曼光譜大約需要0.5秒，這意味著通過點掃描獲得一幅512 × 512像素的拉曼圖像需要36小時。為(wei) 了克服這一限製，人們(men) 已經開發了幾種拉曼成像模式和技術，可分為(wei) 兩(liang) 種主要策略:提高成像采集速度和提高信號強度。
在第①種策略中，對圖像采集設置進行了修改，以提高成像采集速度，以便即使有低拉曼信號，也可以在更短的時間內(nei) 獲取圖像。這通常是通過離開點掃描方法，並試圖同時獲得幾個(ge) 像素來實現的。目前已開發的主要方法是線掃描和縫掃描、寬視場輕片顯微鏡成像和多焦成像。這些方法通常達到比點掃描成像快20倍的采集速度，即使它們(men) 對活細胞成像不夠快，但它們(men) 構成了拉曼光譜許多其他国产成人在线观看免费网站的合適替代品。
在第②種策略中，通過使用不同的拉曼模式來增加拉曼信號的強度，這反過來允許更短的捕獲時間。在腦生理病理研究中，與(yu) 自發拉曼相比，常用三種模式來提高信號強度:非線性拉曼散射技術，如受激拉曼散射(SRS)和相幹反斯托克斯拉曼散射(CARS)，以及表麵增強拉曼散射(SERS)。
圖1
在拉曼散射的非線性模式中，使用多個(ge) 激光刺激特定的振動躍遷，從(cong) 而增加信號的強度。簡單地說，在SRS中，樣品用自發拉曼中的“泵浦”激光照射，並結合較低頻率的“斯托克斯”激光。斯托克斯激光器頻率的選擇使兩(liang) 種激光器之間的能量差(∆v)與(yu) 特定振動躍遷的能量差相似，從(cong) 而增強了該躍遷的發生，並增加了其信號(圖1)。對於(yu) 每個(ge) 泵浦和斯托克斯頻率組合，可以獲得單個(ge) 振動峰值的窄帶測量。通過鎖定其中一個(ge) 激光器的頻率並改變另一個(ge) 激光器的頻率，可以獲得寬帶或高光譜測量，因此可以掃描和檢測振動躍遷的整個(ge) 範圍。信號強度的增加使得512 × 512像素圖像的視頻速率成像達到25fps。此外，在SRS中，信號隨采樣分子的濃度線性縮放，允許定量成像。
CARS也是一種非線性多光子技術，樣品由泵浦和斯托克斯短脈衝(chong) 激光器照射。在SRS中，這些激光經過調諧，使它們(men) 能量差與(yu) 目標分子特定振動躍遷的能量重合，在高於(yu) 基態的能級上誘導特定相幹振動。這些振動分子被第三個(ge) “探測”激光探測，通常與(yu) 泵浦激光頻率相同，使它們(men) 回到基態並產(chan) 生頻率高於(yu) 探測激光的反斯托克斯信號(圖1)。通過固定泵浦激光的波長和改變斯托克斯光束的頻率，可以獲得像SRS中那樣的寬帶測量。CARS實現了信號強度的1000倍提高，並且由於(yu) 散射光是藍移的，因此它不受自熒光的幹擾。與(yu) SRS一樣，信號強度的增加允許更短的采集時間，允許高達20 fps的視頻速率成像。與(yu) SRS不同，CARS信號與(yu) 濃度呈非線性相關(guan) ，因此定量成像並不簡單。
第三種信號增強技術，SERS，依賴於(yu) 修改樣本來增強信號。在SERS中，使用金和銀等金屬納米顆粒，當受到入射光的撞擊時，它們(men) 的表麵會(hui) 產(chan) 生強烈的電磁場，增強目標分子的拉曼信號。這一過程背後的物理現象尚不完全清楚，但已經確定的是，使用SERS信號可以提高到1014-1015倍，甚至可以檢測單個(ge) 分子。因為(wei) 金屬表麵提供了增強，感興(xing) 趣的分子必須與(yu) 被檢測的金屬相互作用。盡管這限製了該技術的国产成人在线观看免费网站，但它可以通過使用靶向特定細胞器或分子的納米顆粒實現選擇性可視化。
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