用單個錐形光纖植入物進行深度分辨光纖光度測定

正文

用單個(ge) 錐形光纖植入物進行深度分辨光纖光度測定

（轉譯自文獻Depth-resolved fiber photometry with a single  tapered optical fiber implant）

活體(ti) 熒光檢測可用於(yu) 記錄和研究自由運動動物腦深部遺傳(chuan) 定義(yi) 的神經群的功能信號。例如，纖維光度法通過監測特定細胞類型神經活動時熒光隨時間變化來實現。這些方法推動了基於(yu) 光子學和光電子平台技術以及使用多路複用技術記錄多個(ge) 亞(ya) 種群活動方法的發展。通常情況下，光纖測量方案依賴於(yu) 扁平切割光纖進行刺激和收集熒光^{2-9,11 - 19}。

然而，由於(yu) 組織散射和吸收效應，扁平切割光纖的可訪問記錄深度僅(jin) 限於(yu) 光纖尖端附近，這與(yu) 探針的幾何形狀相結合，決(jue) 定了熒光激發和收集效率^20,21。簡單的幾何計算表明，扁平切割光纖收集的信號量隨著與(yu) 光纖麵距離的增加而急劇減少。此外，重新配置收集幾何形狀以達到多個(ge) 區域是不可能的，因為(wei) 改變光收集場需要重新定位光纖。此外，扁平切割光纖的幾何形狀嚴(yan) 重損害組織，在大腦中，甚至在植入後很長一段時間內(nei) ，也會(hui) 誘導裝置周圍的神經膠質激活^22,23。盡管如此，平劈光纖被廣泛用於(yu) 評估腦深部區的神經活動^3,11-19。

在這裏，我們(men) 提出了一種克服這些限製的方法:我們(men) 利用TF中光傳(chuan) 播的模態特性在錐度的大光學活性區域上構造光收集模式並進入更深的細胞。除了比扁平切割光纖²²具有更小的侵入性外，TF探針還具有獨特的光收集特征，包括:(i)沿光纖軸在高達2mm的組織上具有均勻的界麵，(ii)通過分時多路複用沿錐度進行多點收集的能力，以及(iii)通過微結構光纖錐度的非平麵表麵來設計任意收集體(ti) 積的能力。

下麵，我們(men) 量化了錐形光纖的三維(3D)光采集區域，發現錐形光纖在大區域(如小鼠的大腦皮質和紋狀體(ti) )均勻地收集熒光。當與(yu) 大麵積光傳(chuan) 輸相結合時^22,24，這導致在有源光學表麵相似的照明功率密度下，錐形光纖比扁平切割光纖的信號采集更高。這是因為(wei) 大麵積的錐形光纖可以提供更多的總照明功率，即更多的光子，同時將電池暴露在中等的功率密度下。我們(men) 的研究表明，通過利用選擇性光傳(chuan) 遞和收集，轉錄因子能夠在自由運動的動物中對功能性熒光信號進行多點探測，包括沿著纖維錐度動態記錄來自多個(ge) 腦區的信號。我們(men) 通過在自由運動的小鼠中使用單個(ge) 錐形光纖完成獎勵收集任務，快速掃描興(xing) 奮光並同時監測背側(ce) 和腹側(ce) 紋狀體(ti) 的多巴胺瞬變，證明了這種實驗的可行性。

zui後，我們(men) 將控製光沿錐度傳(chuan) 播的模態效應與(yu) 金屬塗層錐形光纖表麵的微觀和納米結構相結合，從(cong) 而設計了收集體(ti) 積^25,26。我們(men) 將收集體(ti) 積限製在錐度表麵的一個(ge) 角部分，這樣，光學窗口位於(yu) 沿著錐形光纖界麵的特定深度，隻有很少的細胞體(ti) 。這種方法與(yu) 光學窗口的選擇性光傳(chuan) 輸相結合，提供了具有高度空間選擇性的深度細胞體(ti) 積的雙向接口。

結果

錐形光纖的光收集特性

圖1 |錐形光纖的光收集。a，腦組織中扁平切割光纖（FF）和錐形光纖(TF)的光采集示意圖。實驗收集概況旁邊的纖維。b，對錐形光纖的光采集場成像的光學設置。在pbs -熒光素滴中，一個(ge) 圍繞錐形光纖的雙光子激發點被掃描。產(chan) 生的熒光可通過未脫膜的PMT(顯微鏡PMT)和補片光纖遠端的光纖PMT檢測。Ls，透鏡係統；F1和F2，帶通熒光濾波器；L2,鏡頭。c，在PBS-熒光素溶液中，隨著NAs的增加錐形光纖的典型ξT(x,y)集合字段(每個(ge) 字段歸一化到其zui大值);比例尺，500µm。d，比較在pbs -熒光素溶液中掃描的雙光子熒光光斑采集的光子數(像素停留時間，3.2µs)，內(nei) 嵌扁平切割光纖與(yu) NA = 0.66， ψ = ~4°的錐形光纖；FF圖中的等值線顯示錐形光纖收集到的zui大光子數。比例尺，500µm。e, NA-0.66 錐形光纖在pbs -熒光素溶液中的光子收集的等距線(頂部色條，每個(ge) 像素的光子數;停留時間，3.2µs)；等值線在10、20、50和100光子處繪製。比例尺，500µm。f，上，遠場成像係統示意圖。L1、L2、L3，成像鏡；BPF，帶通濾波器;NBF，近紅外阻斷濾波器；sCOMS，科學互補金屬氧化物半導體(ti) 。底部，纖維輸出小關(guan) 節的遠場圖像顯示，當光源沿著錐形光纖移動時，直徑增加的環。比例尺，0.3 2π/λ。g, 錐形光纖在距離錐尖d處采集的點狀光源熒光的橫向矢量分量kt。a-d的實驗重複了至少10次，得到了相似的結果。

我們(men) 在準透明的熒光溶液中表征了錐形光纖的光聚集特性(圖1)。我們(men) 在浸泡錐形的pbs熒光素(30µM)液滴中實現了一個(ge) 雙光子掃描係統，以產(chan) 生局限的熒光斑，就像各向同性的點狀源一樣(圖1b)。光柵掃描錐度周圍光斑時產(chan) 生的熒光由與(yu) 掃描頭同步的兩(liang) 個(ge) 光電倍增管(PMT)收集:(i)顯微鏡PMT，放置在標準的非脫封，外熒光路徑，和(ii)光纖PMT，置於(yu) 連接的光纖貼片的遠端至錐形光纖^20、21(圖1b)。用顯微鏡PMT得到的參考圖像對視場中雙光子激發效率的輕微不均勻性進行校正後，來自光纖PMT的信號報告了錐形光纖的熒光光采集場，定義(yi) 為(wei) ξT(x,y)。測量了不同數值孔徑(NAs)和芯徑，但錐度角(ψ)近似為(wei) ~4°的光纖的集合場ξT(x,y)(圖1c)。我們(men) 發現沿錐度的光敏區域，即收集長度L，隨著光纖NA的增大和ψ的減小而增大(補充圖1a)。因此，錐形光纖的采集長度是可以定製的通過修改光纖NA和錐度角ψ，從(cong) 幾百微米提高到約2 mm。這一發現揭示了錐形光纖和扁平切割光纖的收集特性的重要差異，因為(wei) 對於(yu) 扁平切割，收集深度基本上不依賴於(yu) NA²¹。

我們(men) 比較了錐形光纖和扁平切割的采集字段，NA分別為(wei) 0.66(圖1d)和0.39(補充圖1b)。錐形光纖的光學主動表麵沿波導軸線延伸，導致沿錐度方向相對均勻的收集。從(cong) 集合字段ξF(x,y)中可以看出，扁平切割光纖在端麵附近采集到較高的信號強度。相反，錐形光纖的收集效率曲線在錐度麵附近達到一個(ge) 較低的zui大值，並遵循在尖端增寬的兩(liang) 葉形狀(圖1e和補充圖1c、d和2)如圖ξ(x,y,z)區域所示(補充圖1d)，被采集信號圍繞錐度軸完全對稱。

這是因為(wei) 錐形光纖表麵通過增加波導直徑²⁷的橫向傳(chuan) 播分量kt的模態子集與(yu) 周圍環境進行光學界麵。因此，由光纖的直部分所支持的全部傳(chuan) 播模式逐漸沿錐形填充，導致錐形光纖軸的均勻收集。相反，扁平切割光纖的所有傳(chuan) 播模式都在纖維麵耦合。

為(wei) 了更好地表征錐度采集光的物理特性，我們(men) 從(cong) 靠近錐度表麵的點樣點對熒光進行雙光子激發時，對所采集光的遠場進行成像(圖1f)。我們(men) 發現不同的模態子集在特定的錐度直徑下被填充(圖1f,g)，因為(wei) 相機上的圖像是一個(ge) 環，它的半徑隨著熒光源和錐度尖端之間的距離的函數而增加。環半徑h是直接測量與(yu) 進入纖維的導模相關(guan) 的波矢量的橫向分量k_t ^27,28。因此，光線從(cong) 錐體(ti) 的不同截麵進入，受到不同的引導模式子集的引導，在相機上產(chan) 生不同直徑的環，從(cong) 而建立了h與(yu) 熒光信號沿錐體(ti) 的位置之間的相關(guan) 性。

圖2 |可重構的錐形光纖光收集。a，與(yu) 熒光素均勻染色腦片皮質接觸的0.66 NA 扁平切割光纖的光采集場ξ(x,y)(左)和光度效率場ρ(x,y)(右)。b，與(yu) a一樣，將0.66-NA 錐形光纖插入經熒光素均勻染色的腦切片中。c，使用全NA照明和藍色激光刺激並收集大大腦區域熒光的係統示意圖。收集的光在貼片光纖中反向傳(chuan) 播，並通過一個(ge) 二色鏡將其導向PMT與(yu) 藍光區分開來。L1和L2，晶狀體(ti) ；BPF，帶通濾波器；Fluo，熒光信號；Exc，激發光。d，定點照明將采樣體(ti) 積限製在錐形光纖的子區域。左，集光域ξT(x,y)；中心，在光纖尖端選擇性照明得到的光度效率場ρT(x,y)；右，ρT(x,y)視場是在較寬錐度直徑下選擇性照明獲得的。e，提出的多站點光度測量係統的原理圖，該係統使用時分複用配置的PMT探測器。藍色激光束以增加的輸入角(θ1， θ2)射入光纖貼片線。低角度注入時，激光在錐尖處耦合，產(chan) 生熒光信號F1；相反，當在θ2處注入時，激光在較大錐度直徑下耦合，產(chan) 生熒光信號F2。熒光由PMT檢測，其輸出信號與(yu) 光注入刺激同步。該熒光信號根據其時間戳歸屬於(yu) 相應的區域。a、b、d實驗重複三次，結果相似。

在大而深的區域統一收集

為(wei) 了證明在存在散射和吸收的情況下，錐形光纖可以在大的和深部腦區獲得均勻的采集，我們(men) 測量了均勻熒光染色的腦片上扁平切割光纖和錐形光纖的熒光采集場ξ(x,y)和熒光激發場β(x,y)。結合這些場得到了光度測量效率場ρ(x,y)，它描述了熒光信號對激發光強度的依賴性^20,21，從(cong) 而給出了采樣組織體(ti) 積的詳盡幾何信息。我們(men) 比較了匹配NA和內(nei) 核大小的扁平切割光纖和錐形光纖的采集和光度視野。如圖2a所示，插入到皮層表麵的扁平切割光纖域ξF(x,y)和域ρF(x,y)，扁平切割光纖有效地與(yu) 皮層的淺層連接;然而，他們(men) 隻提取了距離透鏡麵300 μm以外的信息。相反，錐形光纖的界麵更均勻，錐體(ti) 的光學活性區域周圍有腦組織(圖2b)。利用ξ(x,y)的對稱性，我們(men) 計算了由波導采樣的體(ti) 積作為(wei) 采集信號的函數(補充圖3)，並確定了產(chan) 生給定比例的總采集信號的組織體(ti) 積。我們(men) 發現錐形光纖的體(ti) 積比扁平切割光纖大(補充圖4)。這一特性可以在使用全錐度表麵來激發和收集信號的實驗中加以利用(圖2c)。

沿錐度可重新配置多站點收集

使用位點選擇性光傳(chuan) 輸和模分解複用策略，錐形光纖的收集量可以沿著錐度在多個(ge) 位置之間動態切換^22,27,28。為(wei) 了定義(yi) 可尋址的體(ti) 積幾何配置，我們(men) 獲得了一個(ge) 插入到熒光素染色腦片上的0.66-NA 錐形光纖的ξT(x,y)集合域(圖2d)。使用基於(yu) 振鏡的快速掃描係統(圖2e)，我們(men) 通過增加kt激發模態子集將激光注入錐形光纖，從(cong) 而將照明體(ti) 積限製在可通過改變光輸入角度^22、27、28沿錐度部分逐漸移動的有限區域(補充圖5a、b)。由於(yu) 熒光隻在有限的被照射組織中產(chan) 生(補充圖5a、b)，錐形光纖可以動態地檢查一個(ge) 功能區的多個(ge) 位點。作為(wei) 原理證明，我們(men) 結合ξT(x,y)和β(x,y)，測量了由選址照明產(chan) 生的光度測量效率場ρT(x,y)。ρT(x,y)在可從(cong) 光線注入角度推斷的有限區域內(nei) zui大(圖2d)。利用這一特性，熒光信號可以歸因於(yu) 使用時分複用被照亮的大腦區域(圖2e)。這是通過增加輸入角(θ1， θ2)將激光發射到光纖補片線來激發沿錐度在限製位置耦合的不同模態子集來實現的。每個(ge) 照明位置產(chan) 生的熒光(分別為(wei) F1、F2)由錐度采集，在光纖補片線中反向傳(chuan) 播，由二色鏡識別，zui後由PMT檢測，PMT輸出信號與(yu) 光注入刺激同步(圖2e)。

為(wei) 了證明這種方法對可能由動物運動引起的模態混合有彈性²²，我們(men) 在pbs -熒光素浴中進行深度分辨光度測量時，在手動搖動光纖貼片的同時監測了遠場模式。記錄到的強度波動<1%，遠場環直徑和厚度變化<0.8%(對於(yu) 未受擾動的纖維;補充圖5c、d和補充視頻1、2)。

圖3 |基因染色的神經群增強的光度測定。a，皮質表麵0.39-NA 扁平切割光纖的光采集;從(cong) 左到右:雙光子表觀熒光(2p-epi)圖像，ξ(x,y)場，ρ(x,y)場，軸上采集輪廓ρ(x,y)。b, a為(wei) NA = 0.39 扁平切割光纖，接近L5。c, a,b表示一個(ge) 在大腦皮層插入的0.39 NA的錐形光纖。比例尺(a−c)， 250µm。d，三種實驗配置的光度測量係統示意圖:一個(ge) 錐形光纖插入整個(ge) 皮質，一個(ge) 扁平切割光纖插入L2/3，一個(ge) 扁平切割光纖插入至L5。e, Thy1-ChR2-EYFP小鼠腦片的熒光信號強度(n = 10)，在大腦皮層插入0.39 NA 錐形光纖(ψ = 4°)(藍色)，在L2/3插入0.39- NA 扁平切割光纖(橙色)，在L5插入0.39- NA 扁平切割光纖(紫色)來刺激和檢測熒光。調整激光功率以獲得相似的光活性區域的功率密度(0.1 mW mm-2)。陰影區域表示平均值上的標準誤差。灰線連接在同一實驗中從(cong) 同一腦片獲得的數據。采用雙側(ce) Student t檢驗進行統計學分析，顯著性α = 0.001。f, 錐形光纖插入固定腦片紋狀體(ti) 的亮視野圖像(Thy1-ChR2-EYFP小鼠)。g, f. h中錐形光纖的光采集域ξT(x,y)，將ξT(x,y)域與(yu) 位點選擇性傳(chuan) 遞光相結合，產(chan) 生可重構的紋狀體(ti) 子區域多位點光采集效率域ρT(x,y)。比例尺(f−h)， 250µm。在a-c、g、h重複實驗3次，結果相似。

增強熒光法在基因染色的神經群體(ti)

對於(yu) 錐形光纖，我們(men) 使用了0.39-NA 錐形光纖 (ψ = ~4°)和扁平切割光纖來刺激和檢測Thy1-ChR2-eYFP小鼠固定腦片不同皮質層的熒光，其中EYFP僅(jin) 限於(yu) L2/3和L5(圖3a-c)。我們(men) 測量了三種實驗配置的ξ(x,y)、β(x,y)和ρ(x,y)場:靠近淺層的FF(圖3a)、插入L5層的FF(圖3b)和穿過皮質範圍的錐形光纖 (圖3c)。正如預期的那樣，錐形光纖刺激並收集了L2/3和L5層的熒光，而扁平切割光纖在靠近關(guan) 節突的一個(ge) 有限區域內(nei) 募集信號，需要重新定位以處理這兩(liang) 個(ge) 區域。此外，光纖纖維鈍的幾何輪廓阻礙了光纖的插入，因為(wei) 當光纖穿過切片時，移位的組織仍然在關(guan) 節突的前麵。

我們(men) 比較了三種實驗配置產(chan) 生的絕對信號水平(圖3d)，通過調製激光功率來補償(chang) 錐形光纖的較大光學活性區域，並在每個(ge) 光學表麵提供相同的平均功率密度(~0.1 mW mm^-2)。在這些條件下，錐形光纖在兩(liang) 個(ge) 深度都相對於(yu) 扁平切割光纖產(chan) 生了更大的熒光信號(圖3e)，這可以解釋為(wei) 在光收集和光傳(chuan) 輸中分模解複用的綜合作用。在保持中等功率密度的情況下，模式分複用將較高的總照明功率分布在較寬的表麵^22,27。隨著更多的光子被釋放到組織中，更多的神經元參與(yu) 到收集信號中，更多的熒光被產(chan) 生和檢測到，這與(yu) 之前的研究結果一致，在較低的輸出功率下錐形光纖比扁平切割光纖更能引起光遺傳(chuan) 激活²²。重要的是，由於(yu) 光漂白依賴於(yu) 每個(ge) 熒光團的光暴露，當全部的光活性區域被吸收時，錐形光纖在更大體(ti) 積的組織上的光分布允許產(chan) 生更多的熒光而不增加光漂白。

圖4 |體(ti) 內(nei) 多點光度法揭示了多巴胺對背側(ce) 紋狀體(ti) 和腹側(ce) 紋狀體(ti) 運動和獎勵的不同反應。a，頂部，用於(yu) 活體(ti) 光纖光度測定的手術部位和兩(liang) 個(ge) 部位錐形光纖照明示意圖。下麵是行為(wei) 室的示意圖。紅色區域表示鼠標需要進入盒子的區域來觸發容器(藍色)中的食物顆粒的遞送。在獎勵交付後，至少需要30秒的時間才能交付另一個(ge) 獎勵。b，來自一隻老鼠的光度信號示例。上麵，行為(wei) 時間戳是通過紅外光束在容器中測出的。青色，獎賞的容器入口;洋紅色，沒有獎勵的容器入口。中間，動物的中心速度。底部，dLight光度信號。紅色，來自背部的信號;藍色，腹側(ce) 信號。c，來自示例小鼠的所有試驗的dLight光度信號的熱圖(兩(liang) 個(ge) 階段)。上方，來自背部的信號。底部，來自腹側(ce) 的信號。每一行代表一個(ge) 單獨的試驗。N = 37次獎勵容器進入試驗。N = 435例無獎勵進入容器的試驗。N = 52次運動啟動試驗。d，小鼠所有會(hui) 話的平均速度和dLight光度信號。來自背部的信號顯示為(wei) 紅色;來自腹側(ce) 的信號顯示為(wei) 藍色(n = 8次，來自4隻小鼠)。陰影區域代表會(hui) 話平均值的標準誤差。

體(ti) 內(nei) 空間分辨光度法

為(wei) 了更深入地了解構成運動行為(wei) 和獎賞驅動行為(wei) 基礎的神經過程，光纖光度法已被用於(yu) 探測紋狀體(ti) 神經元的活動^11-13,29。在這種情況下，錐形光纖通過使用一個(ge) 遠程控製的植入物對多個(ge) 區域進行采樣來擴展實驗能力。為(wei) 了支持這一論點，我們(men) 用紋狀體(ti) 中的錐形光纖對位點選擇性熒光法進行了表征(圖3f)。我們(men) 將一個(ge) 0.66-NA 錐形光纖插入Thy1-ChR2- EYFP小鼠固定腦片的紋狀體(ti) 中，在獲得ξ(x,y)場(圖3g)後，我們(men) 使用位點選擇性照明來產(chan) 生增加輸入角度時的光度測量效率ρ(x,y)場(補充圖5)。正如預期的那樣，隨著光輸入角度的增加，響應位點選擇性照明的體(ti) 積逐漸遠離錐形光纖尖端(圖3h)。

我們(men) 使用dLight1.1(參考文獻30)同時測量背側(ce) 紋狀體(ti) 和腹側(ce) 紋狀體(ti) 的多巴胺瞬變，在體(ti) 內(nei) 測試錐形光纖係統，這兩(liang) 個(ge) 腦區顯示出不同的多巴胺信號31。我們(men) 在一個(ge) 簡單的操作性條件反射範式中訓練小鼠，在此期間我們(men) 從(cong) 背側(ce) 和腹側(ce) 紋狀體(ti) 收集dLight熒光(圖4a, NA = 0.39)。在這個(ge) 實驗中，老鼠必須待在房間的一邊，才能觸發食物獎勵從(cong) 位於(yu) 房間另一邊的容器中傳(chuan) 遞出來。這迫使老鼠從(cong) 房間的一邊跑到另一邊去收集獎勵，並在消耗容器中的獎勵時停止移動。

我們(men) 在腹側(ce) 紋狀體(ti) 中觀察到經典的獎賞驅動的多巴胺瞬變，其中dLight熒光在獎賞受體(ti) 進入期間增加，在無獎賞進入期間減少(圖4b-d;補充圖6所示的所有試驗均為(wei) 單獨的小鼠)。然而，對於(yu) 獎賞和未獎賞的受體(ti) 條目，背側(ce) dLight熒光均下降，這表明背側(ce) 紋狀體(ti) 中的多巴胺釋放與(yu) 運動變化的相關(guan) 性更強，而不是與(yu) 獎賞的獲得(圖4b-d)。此外，在獎賞受體(ti) 進入時，背側(ce) 紋狀體(ti) 和腹側(ce) 紋狀體(ti) 由行為(wei) 引起的多巴胺變化的跡象相反，並且與(yu) 多巴胺在運動啟動中的功能一致^32,33，兩(liang) 個(ge) 部位的信號在運動啟動期間增加(圖4b-d)。因此，雖然背側(ce) 紋狀體(ti) 和腹側(ce) 紋狀體(ti) 多巴胺瞬變均追蹤運動，但隻有腹側(ce) 紋狀體(ti) 的多巴胺瞬變對獎勵有強烈反應。

帶有微結構錐形光纖的設計集光體(ti) 積

錐形光纖與(yu) 環境界麵的大表麵允許根據感興(xing) 趣的區域設計收集量(圖5)。這可以通過使用微納米製造技術來構建光纖的錐度來實現，正如在光傳(chuan) 輸中所顯示的那樣^25,26,34。在這裏，我們(men) 展示了:(i)光收集在波導周圍特定角度範圍內(nei) 的限製(圖5a-d)， (ii)當光收集被限製在沿錐度的特定點時，在深層皮質層中對細胞體(ti) 的觀察(圖5e-l)， (iii)選擇性照明和從(cong) 兩(liang) 個(ge) 光學窗口收集，通過操縱激發激光束分別解決(jue) (圖5m,n)。

為(wei) 了限製光的收集到波導表麵的一半，我們(men) 對其對麵的高反射鋁層進行熱蒸發(圖5a)。半包被的TF在光學表麵的ξ(x,y)(圖5b)和剖麵(圖5c)與(yu) 未包被的雙探針在形狀和收集到的光子數方麵相似。因此，金屬塗層並沒有實質性地改變檢測到的信號，這表明幾乎所有進入未塗層錐度的光子都經曆了介電全內(nei) 反射，這是由半塗層光纖中的金屬層強迫的。我們(men) 將半包被的錐形光纖插入由Thy1啟動子控製的表達EYFP的固定腦切片中，在組織中測試了該裝置的側(ce) 采集特性(圖5c)。我們(men) 獲得了一個(ge) 雙光子的表熒光圖像和ξ(x,y)場，並發現盡管在光纖周圍都產(chan) 生了熒光，但光纖PMT隻獲得了在光纖的未塗覆部分附近產(chan) 生的熒光(圖5d)。

圖5 |用微結構錐形光纖設計集光體(ti) 積。a，左，半金屬化TF的掃描電子顯微圖(SEM)。右，在pbs -熒光素溶液中，ξ(x,y)場對半塗覆的0.39-NA TF。b， ξ(x,y)場在pbs -熒光素溶液中。等值線分別用白色、黃色和紅色表示每像素5、10和20個(ge) 光子(停留時間3.2µs)。c， ξ(x,y)對於(yu) 半塗覆錐形光纖(紅色)和未塗覆錐形光纖(藍色)的場分布。d，在固定的腦切片中收集半塗層TF (Thy1-ChR2-EYFP小鼠)。從(cong) 左到右:雙光子表熒光，ξ(x,y)場，合並表熒光(品紅)和ξ(x,y)(青色)。比例尺(a-d)， 250µm。e，設置用於(yu) 表征從(cong) 光學窗口的光收集。插圖，正方形窗的SEM顯微圖(W = ~45µm, L = ~ 1250µm)。f，與(yu) L和W相比，由采集等值麵包圍的pbs -熒光素溶液的采集量分別為(wei) zui大采集量的10%、20%、40%、60%、80%(補充圖6)。g，固定腦片(Thy1-ChR2-EYFP小鼠)的方形窗光采集(W = ~45µm, L = ~750µm);該圖像顯示了ξ(x,y)域(青色)與(yu) 同時獲得的雙光子表觀熒光圖像(品紅)的疊加;比例尺，500µm。插入，放大窗口;比例尺，50µm。h，在光學窗口上方隨高度增加的Z-stack(0、20、40、60µm)。錐形光纖配置文件和窗口位置用白色表示。比例尺，10µm。i，與(yu) g一樣，當TF的時間窗W = ~20µm時，L = ~230µm;比例尺，100µm(插圖，10µm)。l，如h，對於(yu) W = ~20µm的光學窗口:高度為(wei) 0、15、30、50µm的z-stack;比例尺，10µm。m，設置用於(yu) 選擇地點的照明和收集。錐形光纖被淹沒在pbs -熒光素滴中。激光束脈衝(chong) (10 Hz, 50 ms, 473 nm)在受控θ下注入(補充圖7c)。比例尺，500µm。n，從(cong) W1和W2窗口測量的熒光信號，通過操縱θ獨立激活(熒光信號通過減去自身熒光校正)。c、d、g-l、n實驗重複3次，結果相似。

從(cong) 任意深度的光學窗口收集光

我們(men) 探索了在全鋁塗層的TF上製造光學窗來進一步限製收集體(ti) 積的可能性，我們(men) 使用聚焦離子束研磨來選擇性地去除錐形特定區域的金屬^25,26。為(wei) 了優(you) 化該裝置，我們(men) 如上所述對PBS-熒光素溶液(30µM)中光學窗口的光收集進行了表征。我們(men) 製作了不同邊長(W = 60、30、15µm)的光學窗平方的探針(NA = 0.39)，放置在距離光纖尖端不同距離(L = 230、750、1,250µm)處(圖5e、f)。這些設備的體(ti) 積收集圖(補充圖7a)顯示，較大的窗口導致較大的收集量(圖5f)。然而，盡管靠近尖端的窗口從(cong) 略大的體(ti) 積中收集，但在較大的錐形截麵上的窗口具有相似的收集特性(圖5f)。

我們(men) 在Thy1-ChR2-EYFP小鼠的固定腦片上，通過采集ξ(x,y)場與(yu) 同步外熒光成像相關(guan) 聯，測試了微結構錐形光纖的光學性能。我們(men) 發現，對於(yu) 窗寬W = ~45µm，位於(yu) 距錐尖L = ~750µm的錐形光纖，光集合與(yu) 光學窗口位置共定位，其集合葉不垂直於(yu) 纖維軸，而是指向錐尖(圖5g)。這一特性與(yu) 來自光學窗的選擇性光傳(chuan) 遞密切相關(guan) ²⁵，因為(wei) 它允許在深度上與(yu) 細胞體(ti) 積進行界麵，具有高空間選擇性(圖5h)。此外，從(cong) 光學窗口附近的區域獲得的三維熒光堆棧(側(ce) W = ~45µm, L = ~750µm)(圖5h和補充圖7b)顯示了光度圖和表觀熒光成像的精確匹配。我們(men) 使用窗口寬度W = ~25µm的錐形光纖得到了類似的結果，錐形光纖位於(yu) 距尖端L = ~230µm處(圖5i, L)。

正如我們(men) 所展示的，對於(yu) 未塗覆的錐形光纖，可以利用分模解複用策略選擇性地激發和收集來自同一錐形光纖不同截麵的兩(liang) 個(ge) 光學窗口的熒光(圖5m和補充圖7c)。為(wei) 此，我們(men) 將微結構錐形光纖浸入熒光素滴中，並在不同的輸入角度注入473 nm的激光束，以每次選擇一個(ge) 窗口(補充圖7c)。我們(men) 用聲光調製器(10 Hz, 50%占空比方波)調製激光功率時，用光電探測器測量采集到的熒光信號(圖5n)。熒光在每個(ge) 窗口位置被選擇性激發，表明錐形光纖可以選擇性地照亮和收集來自兩(liang) 個(ge) 受限區域的光(圖5m,n和補充圖7c)。

圖6 |利用遠場成像進行深度分辨光纖測光的檢測方案。a、遠場檢測熒光支持時分複用，提高深度選擇性。b，通過全NA刺激實現遠場檢測，實現基於(yu) 反向傳(chuan) 播熒光的kT值的純分模解複用。Fluo，熒光信號;Exc，激發光。

討論

在神經科學中，從(cong) 大腦中表達的活動指示器獲取熒光信號是一項強大的技術^35,36，可植入式波導係統將極大地造福神經科學領域，該係統可配置為(wei) 有效和選擇性地收集感興(xing) 趣區域的光。此外，本文中提出的方法可以在使用遠場檢測來獲得光纖光度實驗中的深度選擇性方麵打開進一步的視角(圖6)。

我們(men) 設想国产成人在线观看免费网站錐形光纖探針從(cong) 散射組織中收集熒光，將有助於(yu) 解剖腦深部多個(ge) 功能區的貢獻，同時為(wei) 現有的光學方法提供一個(ge) 通用的補充。基於(yu) 錐形光纖的分模解複用的光度測定方法也可以潛在地擴展到大類別的軟的、生物的、活組織，其中大腦代表了散射特性方麵具有挑戰性的情況之一，考慮到散射長度和各向異性。在這個(ge) 框架中，錐形光纖為(wei) 現有的光收集設備增加了有益的功能，使用了扁平切割光纖或µLED/光電探測器係統無法實現的不同配置¹⁰。

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