在光學顯微鏡中，不言而喻，隻能從(cong) 標本被照亮的部分獲得信息。當然，如果照明在空間上不均勻，那麽(me) 這種不均勻性將使圖像數據產(chan) 生偏差。然而，照明場的有意進行特殊配置是過去25年中出現的許多提高熒光顯微鏡的空間分辨率技術的基礎。在文本中，我們(men) 將介紹固態光源的輸出特性以及它們(men) 如何傳(chuan) 播到成像国产成人在线观看免费网站中。
固態光引擎的空間光輸出特性
1. 固態光源：激光器和LED
光引擎是一個(ge) 緊湊的固態光源陣列，在統一的控製基礎設施下運行，並饋入統一的光輸出路徑（圖1）。陣列的元件可以是LED或激光器或兩(liang) 者的混合，具體(ti) 取決(jue) 於(yu) 預期国产成人在线观看免费网站的要求。在本文中，我們(men) 將把激光器的考慮限製在半導體(ti) 激光器上，半導體(ti) 激光器的總體(ti) 尺寸與(yu) LED相似，允許它們(men) 被納入陣列中，而無需從(cong) 根本上重新設計支持基礎結構。
實際上，LED和激光器在三個(ge) 重要方麵有所不同：
（1） 光譜分布（圖1）
（2） 光輸出生成效率（圖2）
（3） 輸出空間分布（圖3）。
激光的光譜帶寬較窄（圖1），這在熒光顯微鏡中並不特別重要，因為(wei) 熒光染料和熒光蛋白的光譜帶寬通常大於(yu) LED或激光。相反，是輸出空間分布，方便地表示為(wei) 光學擴展量（étendue）[1]，這主要區分LED和激光器的下遊国产成人在线观看免费网站。一般來說，光學擴展量是器件的發光表麵積與(yu) 來自該麵積的光的角發散度的乘積。因此，激光器的光學擴展量值比LED小得多（表1）。這使得LED主要適用於(yu) 寬視場熒光顯微鏡，主要用於(yu) 觀察二維樣品，在較大的視場範圍內(nei) ，其空間分辨率高於(yu) 衍射極限（>200 nm）。激光器更適用於(yu) 需要高輻射強度的国产成人在线观看免费网站（表1），如共聚焦顯微鏡，單分子定位顯微鏡和超分辨率顯微鏡。
圖1所示。由4個(ge) 固態光源陣列組成的光引擎示意圖。在實踐中，根據国产成人在线观看免费网站需求，源的數量可以在2-21之間。光源可以是LED（產(chan) 生光譜輸出，如右上所示）或激光（產(chan) 生光譜輸出，如右下所示）。可以對LED進行濾波(F)以選擇LED光譜輸出的子集。
圖2. LED和激光器的光輸出與(yu) 驅動電流關(guan) 係。LED通過半導體(ti) 的PN結產(chan) 生光輸出。半導體(ti) 激光器是類似的，除了光的產(chan) 生被限製在半導體(ti) 內(nei) 的一個(ge) 小腔內(nei) （圖4），在那裏它被放大，導致在大多數驅動電流水平具有更高的輸出功率。
圖3. LED光輸出的朗伯空間分布。熒光顯微鏡国产成人在线观看免费网站通常利用光輸出ϴ從(cong) 0到60°。
用於(yu) 熒光顯微鏡国产成人在线观看免费网站的單個(ge) LED光源通常具有1mm×1mm的發光表麵。從(cong) 該表麵發出的光具有朗伯空間分布（Lambertian spatial distribution）（見圖3），這些光必須被準直並z終聚焦以用於(yu) 顯微鏡。顯微鏡的光學擴展量限製了可以有效利用的朗伯輸出分布的多少。通常，這是一個(ge) 60度半角的錐形，代表了LED總輸出的大約90%。半導體(ti) 激光從(cong) 在多層半導體(ti) 結構中形成的諧振光學腔中發出光（見圖4）。激光二極管的發光麵積大約比LED小4個(ge) 數量級（0.0001mm2對比1mm2），使其能夠在更小的發散角內(nei) 提供類似的功率輸出。激光腔的橫向寬度（發射區寬度，見圖4）決(jue) 定了激光是單模（寬度<10μm）還是多模（寬度>50μm）。就国产成人在线观看免费网站而言，單模和多模半導體(ti) 激光器在輸出功率和角度發散之間代表著一種權衡。
圖4. 法布裏-珀羅（FP）半導體(ti) 激光器示意圖。整機尺寸一般為(wei) 1000µm×500µm×200µm（長×寬×高）。對於(yu) 單模激光器，發射區寬度小於(yu) 10 μ m，對於(yu) 高度為(wei) 1 μ m的多模激光器，發射區寬度小於(yu) 50 μm。
除了高輻射強度和小光學擴展量（見表1）之外，激光源的光輸出是相幹的，而LED的光輸出則不是。當激光的相幹光被光學粗糙表麵反射而隨機化時，結果就會(hui) 產(chan) 生激光散斑（見圖5）。在需要均勻照明場的国产成人在线观看免费网站中，激光散斑顯然是不利的。在這種情況下，可以對激光輸出国产成人在线观看免费网站各種技術來擾亂(luan) 其時間或空間相幹性[2]。另一方麵，激光散斑可用於(yu) 測量表麵粗糙度或散射粒子的運動。這些国产成人在线观看免费网站中值得注意的是激光散斑對比成像（LCSI），它用於(yu) 測量組織中的血液灌注[3]。
圖5.（左）由ZIVA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）輸出的488nm激光產(chan) 生的激光散斑圖案。（右）相同的488nm激光輸出後，通過一個(ge) 旋轉式散斑消除器。
1. 液體(ti) 光導（LLG）和光纖輸出
液體(ti) 光導和光纖提供了從(cong) 光引擎向下遊光學分析係統（如顯微鏡）傳(chuan) 遞光輸出的柔性通道。液體(ti) 光導通常具有比光纖更大的橫截麵積和更大的角度接受範圍（數值孔徑）。因此，光纖通常（盡管不專(zhuan) 用於(yu) ）與(yu) 激光光引擎配合使用，而液體(ti) 光導與(yu) LED光引擎配合使用。LED和激光光引擎產(chan) 生的光的角度分布傳(chuan) 播特性展示在圖6中。圖6（a）顯示了表征方法。根據光傳(chuan) 輸線出口與(yu) 投影屏幕之間的已知距離，通過相機檢測到的投影輻射光強度值被轉換為(wei) 數值孔徑（NA），通過国产成人在线观看免费网站公式NA = n.sinθ。圖6中的數據展示了幾個(ge) 顯著特點。如預期的那樣，基於(yu) 第1節中描述的特性，通過液體(ti) 光導傳(chuan) 播的LED光引擎的角度分布比通過多模光纖傳(chuan) 播的激光光引擎的角度分布更寬（比較圖（b）和（c）與(yu) 圖（d）和（e））。在圖（d）和（e）中明顯可見的不同激光輻射角度分布差異歸因於(yu) 源激光的多模輸出。通過添加下遊的光束整形光學元件（圖（f）和（g）），獲得了消色差的角度分布。這一特性對於(yu) 使用多色熒光顯微鏡定量確定細胞和組織中分子共定位至關(guan) 重要[4]。
圖6.（a）角度光分布表征方法。通過Thorlabs DCC1240M cmos相機捕捉投影的輻射光分布。
（b）由SOLA V-N LED光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）產(chan) 生的未過濾白光（380–760 nm）通過直徑為(wei) 3毫米或5毫米的液體(ti) 光導傳(chuan) 輸後的角度分布。
（c）由多源SPECTRA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）產(chan) 生的過濾LED和激光光通過直徑為(wei) 3毫米的液體(ti) 光導傳(chuan) 輸後的角度分布。紫色LED = 395 nm，青色LED = 475 nm，綠色LED = 555 nm，黃色 = 575 nm，均具有25 nm帶寬。激光中心波長為(wei) 637 nm（紅色）和748 nm（近紅外）。
（d）由CELESTA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）產(chan) 生的光通過直徑為(wei) 1.5毫米（NA = 0.39）的多模光纖傳(chuan) 輸後的角度分布。激光中心波長為(wei) 405 nm（紫色）、477 nm（青色）、545 nm（綠色）和639 nm（紅色）。
（e）由CELESTA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）產(chan) 生的光通過方形0.4毫米×0.4毫米（NA = 0.22）的多模光纖傳(chuan) 輸後的角度分布。激光中心波長為(wei) 405 nm（紫色）、477 nm（青色）、545 nm（綠色）和639 nm（紅色）。
（f）與(yu) （e）相同，但光纖遠端的光輸出通過Thorlabs F950多模準直器。
（g）與(yu) （e）相同，但光纖遠端的光輸出通過Lumencor臨(lin) 界落射照明器（另見圖8）。
3. 熒光顯微鏡照明
柯勒照明（圖7）自1893年引入以來，一直是寬場落射熒光顯微鏡的主要照明方法[5]。柯勒照明開發的主要動機之一是來自白熾燈燈絲(si) 的照明不均勻性，或者是放電燈弧的漂移或閃爍。柯勒照明通過將光源置於(yu) 成像樣本平麵的焦點之外（圖7）來消除這些問題。像激光和LED這樣的固態光源本質上更具空間均勻性，使得實施臨(lin) 界照明成為(wei) 可能，在臨(lin) 界照明中，光源在圖像平麵上聚焦（圖7）。LED提供的柯勒照明在樣本平麵上的照射強度為(wei) 1-100 mW/mm²，這對於(yu) 寬場熒光顯微鏡來說已經足夠。然而，柯勒照明相對效率較低，因為(wei) 它並沒有傳(chuan) 播光源發出的全部麵積或全部角度分布的光。對於(yu) 像單分子定位顯微鏡（SMLM）這樣的特殊成像技術，需要更高水平的照射強度，大約為(wei) 10,000 mW/mm²（1 kW/cm²）[6]。這可以通過使用臨(lin) 界落射照明器實現，該照明器將激光光引擎輸出的超過50%的輸出功率傳(chuan) 遞到樣本平麵（圖8）。臨(lin) 界落射照明器產(chan) 生均勻的、高照射強度的照明，其覆蓋麵積與(yu) 用於(yu) 成像的scmos相機傳(chuan) 感器的麵積相匹配。
圖7. （A）柯勒照明和（B）臨(lin) 界照明的光學示意圖。圖A中的垂直虛線表示物鏡的後焦平麵。
圖8. 使用CELESTA 光引擎成像的均勻熒光玻璃，該引擎通過800 µm直徑的光纖耦合到安裝在Nikon Ti/Ti 2顯微鏡中的臨(lin) 界落射照明器。使用Nikon 60 X/1.4 NA Plan Apo物鏡和Andor Zyla 5.5（2560 x 2160像素）sCMOS相機拍攝圖像。該圖顯示了攝像機沿著標記為(wei) 紅色的對角線軸記錄的灰度值。右上角的插圖顯示了用Nikon 10 X/0.3 NA Plan Apo物鏡成像的相同樣品。
轉盤共聚焦顯微鏡（Spinning Disk Confocal Microscopy, SDCM）利用臨(lin) 界照明來補償(chang) 因空間濾波以排除焦平麵scmos外光而造成的光通量損失[7]。早期的SDCM實現使用單模激光通過單模光纖耦合到掃描頭（東(dong) 京橫河電機）。然而，這種配置容易出現光學錯位，並且常常在樣本平麵上產(chan) 生不均勻的照明。通過ZIVA光引擎（Lumencor, Beaverton, OR）實現了顯著改進。ZIVA光引擎整合了七個(ge) 多模激光源，通過直接電子開關(guan) 進行波長選擇，無需像聲光可調諧濾波器（Acousto-Optic Tunable filters, AOTFs）這樣的輔助輸出調製器。光引擎整合了光束整形和消散斑光學元件，產(chan) 生與(yu) 記錄樣本圖像的sCMOS傳(chuan) 感器尺寸布局相匹配的方形照明輪廓（見圖5）。光輸出通過精密設計的適配器耦合到橫河CSU-W1掃描器，在樣本平麵上產(chan) 生強烈且均勻的照明。通過省略AOTFs和耦合光纖等中間光學元件，提高了光通量，並且相對於(yu) 單模激光發射，減小了係統的尺寸和成本。
全內(nei) 反射顯微鏡（total internal reflection Microscopy, TIRF）通過將熒光激發限製在樣本平麵100 nm範圍內(nei) ，來消除焦平麵外光的成像（相比之下， SDCM的z軸分辨率約為(wei) 500 nm）。TIRF通常通過將激光聚焦到一個(ge) 非常高數值孔徑物鏡的後焦平麵上的一個(ge) 約50μm直徑的光斑來實現（“物鏡TIRF”，[8]）。然而，通過將LED的輸出通過一個(ge) 環形掩模投影到物鏡的後焦平麵上，也可以有效地實現TIRF的照明[9]。物鏡TIRF所需的高放大倍數物鏡導致視野有限。這一限製可以通過使用波導TIRF來克服，在波導TIRF中，樣本直接放置在高折射率的玻璃蓋片上，該蓋片通過邊緣耦合連接由LED或激光提供的照明[10]。
總之，LED和激光在光譜分布、電光轉換效率和輸出空間分布方麵有著明顯的區別。其中，空間分布對於(yu) 定義(yi) 它們(men) 的国产成人在线观看免费网站非常重要。即便如此，激光国产成人在线观看免费网站和LED国产成人在线观看免费网站之間存在著相當大的重疊，這得益於(yu) 能夠在共同的控製和光學基礎設計下容納這兩(liang) 種類型的光源。z終，隻有在仔細考慮空間分布的同時，結合針對分析和成像儀(yi) 器需求定製的光譜和強度規格，才能構建出適當的照明，以服務於(yu) 眾(zhong) 多需要光子支持的生命科學和材料科學国产成人在线观看免费网站。
如果您對Lumencor光源有興(xing) 趣，請訪問上海昊量光電的官方網頁：
https://www.weilancj.com/three-level-330.html
更多詳情請聯係昊量光電/歡迎直接聯係昊量光電
關(guan) 於(yu) 昊量光電：
上海昊量光電設備有限国产黄色在线观看是光電国产欧美在线專(zhuan) 業(ye) 代理商，国产欧美在线包括各類激光器、光電調製器、光學測量設備、光學元件等，涉及国产成人在线观看免费网站涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫療、科學研究、國防、量子光學、生物顯微、物聯傳(chuan) 感、激光製造等；可為(wei) 客戶提供完整的設備安裝，培訓，硬件開發，軟件開發，係統集成等服務。
您可以通過我們(men) 昊量光電的官方網站www.weilancj.com了解更多的国产欧美在线信息，或直接來電谘詢4006-888-532。
參考文獻：
[1] W Mönch (2015) Adv Opt Techn 4:79–85
[2] V Kumar, AK Dubey DS Mehta et al. (2021) Opt Laser Technol 141:107079
[3] W Heeman, W Steenbergen, EC Boerma et al. (2019) J Biomed Opt 24:1–11
[4] J Waters (2009) J Cell Biol 185:1135–1148
[5] A Nolte, JB Pawley L. Höring (2006) in Handbook of Biological Confocal Microscopy, (3rd Edition), JB Pawley (Ed) pp 126–144
[6] R Diekmann, M Kahnwald, J Rise et al. Nat Methods (2020) 17:909–912
[7] J Oreopoulos, R Berman, M Browne (2014) Methods Cell Biol 123:153–175
[8] A Yildiz, RD Vale (2015) Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top086348
[9] C Suckert, C Zosel, M Schaefer (2024) Cell Calcium 120:102883
[10] S Ramachandran, DA Cohen, R Lal et al. (2013) Sci Rep 3:2133
展示全部 
