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科普-超分辨顯微成像之多波長合束激光器

發布時間:2019-01-30 13:54:30 瀏覽量:6133 作者:Micheal

摘要

多波長合束激光器(通用型激光引擎),它可將8個(ge) 不同波長的激光耦合到一根單模或保偏光纖之中輸出,能同時或單獨對每一路激光

進行控製,單波長功率可達300mW。此外OXXIUS可根據客戶不同的要求進行量身定製化的服務。同時我們(men) 具有遠程診斷修複和自我

保護功能,同時具有通過USB和RS232接口進行軟件控製。激光器可進行高速模擬調製或TTL調製。

正文

曾經有這樣一個(ge) 傳(chuan) 言,“中國的萬(wan) 裏長城是太空中能看到的地球上唯一的人工建築”,這讓我們(men) 中國人自豪無比。但神舟載人飛船上天後,包括楊利偉(wei) 、劉洋在內(nei) 的眾(zhong) 多航天員都曾說過,“沒有看到長城”,這是為(wei) 何呢?

長城

其實人眼的分辨率很有限,隻有0.3角分左右,即便在二百公裏左右的近地點軌道高度上,不考慮任何天氣因素,人眼至多看清17米以上的目標,因此對於(yu) 寬度不過七八米的長城,確實有心無力了。當然了,若是不考慮“看清”,而隻是“看到”,那麽(me) 隻要在夜間將長城照的燈火通明,太空中的宇航員就有可能“看到”長城了。不過這就像遠遠看到商店的霓虹燈箱,卻看不清楚燈箱的字一樣,不屬於(yu) 我們(men) 此處討論的範疇。

200公裏左右太空看長城效果示意圖


成像係統的分辨率之所以會(hui) 受到限製,除了光學元件存在像差之外,更重要的原因是光波存在衍射效應,使得一個(ge) 理想無限小的點物體(ti) 發射的光波通過係統成像後,由於(yu) 成像係統口徑有限,物體(ti) 光的高頻成分被阻擋,最終參與(yu) 成像的隻有物體(ti) 光波的低頻成分(因此傳(chuan) 統成像係統本質上相當於(yu) 一個(ge) 低通濾波),使得最終的像不再是一個(ge) 無限小的理想點,而成為(wei) 了一個(ge) 彌散的亮斑,稱為(wei) “艾裏斑”。

因此當兩(liang) 個(ge) 點物體(ti) 距離較近時,它們(men) 通過成像係統後形成的兩(liang) 個(ge) 艾裏斑就會(hui) 重疊到一起無法分辨,兩(liang) 個(ge) 物點恰能分辨的距離就是極限分辨距離,對應的張角即為(wei) 極限分辨角,這就是著名的“瑞利判據”。科學家發現,通常情況下該極限分辨率與(yu) 光的波長(λ)、成像係統口徑(D)和數值孔徑(NA)等參數有關(guan) 。

瑞利判據


為(wei) 了獲得更好的成像效果,科學家嚐試了許許多多的方法:在光刻係統中使用越來越短的光波(如目前因特爾等芯片企業(ye) 已開始使用極紫外光),擴大成像係統口徑(如天文望遠鏡口徑已達到10米以上),增加成像係統數值孔徑(如顯微成像係統使用浸油等方式獲得更大的NA)等,但這些方法都未能擺脫理論極限的影響。

衍射極限”仿佛是一片籠罩在頭頂的陰霾,成為(wei) 了看似堅不可摧的障礙。為(wei) 了能夠打破這個(ge) 枷鎖和桎梏,實現超分辨成像,科學家們(men) 真是腦洞大開,展現出了無窮的智慧。


讓我們(men) 看看科學家們(men) 通過哪些方法打破桎梏:
結構光照明顯微(SIM)
普通光學顯微鏡的成像過程可以通過點擴展函數進行描述,通過對點擴展函數進行傅裏葉變換,可獲得顯微係統的光學傳(chuan) 遞函數。由於(yu) 衍射極限的存在,光學傳(chuan) 遞函數限製了通過顯微係統的信息量,隻允許低頻信息通過係統,濾除代表細節的高頻信息,即限製了係統的分辨率。

結構光照明顯微鏡實現超分辨的原理,就是利用特定結構的照明光 在成像過程把位於(yu) 光學傳(chuan) 遞函數範圍外的一部分信息轉移到範圍內(nei) ,利用特定算法將範圍內(nei) 的高頻信息移動到原始位置,從(cong) 而擴展通過顯微係統的樣品頻域信息,使得重構圖像的分辨率超越衍射極限的限製。

對於(yu) 光學顯微鏡係統,光學傳(chuan) 遞函數的三維結構是圓環結構,在零頻位置存在凹陷。凹陷帶來的後果就是ccd 上記錄的信息不僅(jin) 包含物鏡焦平麵上的樣品信息,同時包含焦平麵外的樣品信息。由於(yu) 受到焦平麵外的信息的幹擾,常規熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結構光照明顯微鏡提高分辨率、獲得層析圖像的原理,就是利用特定結構的照明光來獲得樣品的高頻信息,采用特定算法在橫向和縱向上擴展樣品頻域信息的同時彌補凹陷帶來的影響。

飽和結構照明顯微鏡(SSIM)的原理


法國Oxxius多波長合束激光器国产成人在线观看免费网站在Nikon顯微鏡


激發射損耗顯微(STED)

在STED顯微術中,有效熒光發光麵積的減小是通過受激發射效應來實現的。一個(ge) 典型的STED顯微係統中需要兩(liang) 束照明光,其中一束為(wei) 激發光,另外一束為(wei) 損耗光。當激發光的照射使得其衍射斑範圍內(nei) 的熒光分子被激發,其中的 電子躍遷激發態後,損耗光使得部分處於(yu) 激發光斑外圍的電子以受激發射的方式回到基態,其餘(yu) 位於(yu) 激發光斑中心的被激發電子則不受損耗光的影響,繼續以自發熒光的方式回到基態。


由於(yu) 在受激發射過程中所發出的熒光和自發熒光的波長及傳(chuan) 播方向均不同,因此真正被探測器所接受到的光子均是由位於(yu) 激發光斑中心部分的熒光樣品通過自發熒光方式產(chan) 生的。由此,有效熒光的發光麵積得以減小,從(cong) 而提高了係統的分辨率。STED顯微術能實現超分辨的另一個(ge) 關(guan) 鍵在於(yu) 受激發射與(yu) 自發熒光相互競爭(zheng) 中的非線性效應。


當損耗光照射在激發光斑的邊緣位置使得該處樣品中的電子發生受激發射作用時,部分電子不可避免地仍然會(hui) 以自發熒光的方式回到基態。然而當損耗光的強度超過某一閾值之後,受激發射過程將出現飽和,此時以受激發射方式回到基態的電子將占絕大多數,而以自發熒光方式回到基態的電子則可以忽略不計。因此,通過增大損耗光的強度,使得激發光斑範圍內(nei) 更多範圍的自發熒光被抑製,可以提高STED顯微術的分辨率。

受激發射損耗(STED)顯微的原理

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STORM和PALM超分辨顯微成像技術

STORM技術中,使用Cy3和Cy5分子對作為(wei) 熒光標記實現超分辨成像,因為(wei) 不同波長光可以控製Cy5在熒光激發態和暗態之間切換,例如紅色633nm激光可以激活Cy5發射熒光,同時長時間照射可以將Cy5分子轉換成暗態不發光。之後用綠色的532nm激光照射Cy5分子時,可以將其從(cong) 暗態轉換成熒光態,而此過程的長短依賴於(yu) 第二個(ge) 熒光分子Cy3和Cy5之間的距離,因此,當Cy3和Cy5交聯成分子對時,具備了特定的激發光轉換熒光分子發射波長的特性。


在顯微觀察前,首先將待測觀察樣品用染劑染色,將Cy3和Cy5分子對膠聯到特異的蛋白質抗體(ti) 上,就可以用抗體(ti) 來標記細胞的內(nei) 源蛋白,然後用波長為(wei) 633nm的紅光長時間照射樣品使Cy5發射熒光後全部轉化為(wei) 暗態,采用波長為(wei) 532nm的綠光激發Cy3,從(cong) 而使Cy5處於(yu) 熒光態。激發過程中應使532nm綠光強度足夠低,以保證在衍射極限範圍內(nei) 至多隻有一個(ge) Cy5熒光分子被激活至熒光態。而後,用波長為(wei) 633nm的紅色激光照射待觀察樣品,使處於(yu) 熒光態的Cy5分子發射熒光。通過電子相機讀取熒光圖像,采用函數擬合的方法對圖像進行處理,進而確定每個(ge) 熒光點的中心位置。經過足夠多次數循環後對獲得的熒光點位置進行疊加,最終得到超分辨顯微圖像。

STORM技術中熒光開關(guan) 原理圖


PALM技術中,使用GFP突變體(ti) 作為(wei) 光活化蛋白(PA-GFP)來標記靶蛋白,並在細胞中表達。用405nm激光器低能量照射細胞表麵,一次僅(jin) 激活出稀疏分布的幾個(ge) 熒光分子,然後用561nm激光激發得到熒光,通過高斯擬合來精確定位這些熒光分子,在確定這些分子的位置後,長時間使用561nm激光來漂白這些已經定位正確的熒光分子後,使他們(men) 不能夠被下一輪的激光再激活出來。


再分別用405nm和561nm激光來激活、激發和漂白其他熒光分子,多次成像後,將這些分子的熒光圖像合成到一張圖上,得到了比傳(chuan) 統光學顯微鏡至少高10倍以上的分辨率。PALM顯微鏡的分辨率僅(jin) 僅(jin) 受限於(yu) 單分子成像的定位精度,理論上來說可以達到1nm的數量級。PALM的成像方法隻能用來觀察外源表達的蛋白質,而對於(yu) 分辨細胞內(nei) 源蛋白質的定位無能為(wei) 力。


STROM與(yu) PALM的基本原理一致,區別在於(yu) STORM使用的熒光開關(guan) 基團是有機熒光分子對,而PALM使用的熒光開關(guan) 基團是熒光蛋白分子,由於(yu) STORM具有對細胞內(nei) 源性生物分子成像的優(you) 勢,目前STORM在活細胞等生物體(ti) 係的国产成人在线观看免费网站更加廣泛。在空間分辨率上,STORM可以達到10-20nm,PALM可以達到20-30nm;在時間分辨率上,STORM可以達到1s,而PALM約為(wei) 30s。

STORM與(yu) 常規顯微成像方法對細胞內(nei) 微管成像效果對比

什麽(me) 是多波長合束激光器?

合束激光器就是將多個(ge) 波長光合束到一起輸出,它把合束/分束、透鏡、整形器件等全部集成並做了穩固性的設計,各波長獨立控製。可以讓科研工作者或工程師們(men) 專(zhuan) 心於(yu) 試驗部分而不是做複雜的光路調節

傳(chuan) 統合束光路

OXXIUS合束激光器內(nei) 部光路設計


OXXIUS合束激光器都有啥幹貨?

最多8波長輸出~緊湊合理的尺寸~高穩定輸出功率~高光束質量~高速調製功能~強大智能性….
L4Cc是一款緊湊型多波長合束激光器(通用型激光引擎),它可將8個(ge) 不同波長的激光耦合到一根單模或保偏光纖之中輸出,能同時或單獨對每一路激光進行控製,單波長功率可達300mW。此外OXXIUS可根據客戶不同的要求進行量身定製化的服務。同時我們(men) 具有遠程診斷修複和自我保護功能,同時具有通過USB和RS232接口進行軟件控製。激光器可進行高速模擬調製或TTL調製。


国产欧美在线特點:
客戶可以自由選擇合束激光的數量(2個(ge) 到 8個(ge) 波長可選
自由空間光輸出/各種光纖耦合輸出可選;
單光路或多光路輸出
智能性強(遠程診斷修複和自我保護功能);
軟件控製(通過USB和RS232接口)
高穩定性,光束質量高,噪聲低;
百MHZ的TTL調製功能和模擬調製;
結構緊湊,堅固耐用;
可根據客戶的要求定製,不收取定製費;
高性價(jia) 比;


主要国产成人在线观看免费网站:超分辨率成像、共聚焦顯微鏡、熒光激發、流式細胞儀(yi) 、SPIM、FRAP、TIRF……

典型波長參數:

波長

405nm

488nm

532nm/561nm

638nm

輸出功率

0-300mw

0-200mw

0-500mw

0-500mw

功率調節範圍

0-100%

0-100%

0-100%

0-100%

模擬調製

3MHZ

TTL調製

150MHZ

光束質量(M^2)

                       <1.1

激光器尺寸

250mm*200mm*108mm

工作電壓

220VAC

      

OXXIUS合束激光器家族部分解決(jue) 方案:

(單光路輸出)                                      (雙光路輸出)


(8波長四光路輸出)                       (6波長可插拔光纖輸出)


OXXIUS国产黄色在线观看其它激光器: