門控單光子雪崩二極管(SPAD)陣列在相量- flim的廣域時間的上的国产成人在线观看免费网站，通過門長度、門數和信號強度可以提高測量壽命精度和準確度。該探測器的功能基本上是一個(ge) 理想的鏡頭噪聲限製傳(chuan) 感器，並能夠以視頻速率進行FLIM測量。即使在門的數量很少和光子數量有限的情況下，在這項工作中使用的相量方法似乎非常適合處理由這種類型的非常大的傳(chuan) 感器(512× 512像素)產(chan) 生的大量數據。
在相量分析法中熒光壽命測量的国产成人在线观看免费网站
一．簡介
在現有的許多光學成像模式中，熒光壽命顯微成像技術（fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）由於(yu) 其多功能性和特異性在生物科學和材料科學中特別受歡迎。熒光壽命顯微成像主要針對的是分子級別的成像，可以做到排除幹擾分子後，對感興(xing) 趣的分子進行針對性的成像，主要通過大量具有明顯吸收和發射光譜的熒光團實現的。成為(wei) 當前分子層麵上熒光測試的首先，廣泛国产成人在线观看免费网站在DNA測序、診斷、細胞成像、超分辨率顯微鏡，甚至是国产成人在线观看免费网站在疾病的縱向(前期)臨(lin) 床研究和治療監測的體(ti) 內(nei) 成像。
相量分析法（phasor analysis，PA）可以通過時域和頻域的轉化直接進行熒光壽命的檢測。與(yu) 傳(chuan) 統的分析方法（比如Z小二乘法）相比，顯得更加的簡便快速，對光子數量少的情形下的測量尤為(wei) 重要。數據信息的可視化和聚類分析的特點，相量分析法成為(wei) 了科研工作者分析熒光壽命的不錯選擇。
門控單光子雪崩二極管(SPAD)陣列在相量- flim的廣域時間的上的国产成人在线观看免费网站，通過門長度、門數和信號強度可以提高測量壽命精度和準確度。該探測器的功能基本上是一個(ge) 理想的鏡頭噪聲限製傳(chuan) 感器，並能夠以視頻速率進行FLIM測量。即使在門的數量很少和光子數量有限的情況下，在這項工作中使用的相量方法似乎非常適合處理由這種類型的非常大的傳(chuan) 感器(512× 512像素)產(chan) 生的大量數據。
昊量光電推出了一款可以国产成人在线观看免费网站於(yu) 相量分析熒光壽命的設備
，歡迎大家學習(xi) 溝通。
二．相量分析法（Phasor-FLIM）的原理介紹
頻域法和時域法是相量分析法中核心，傅裏葉變換技術可以讓兩(liang) 者靈活轉變，但它們(men) 獲取熒光壽命信息的方式不同，得到的數據內(nei) 容和形式不同，從(cong) 而數據處理方法一般也不同。頻域法一般使用正弦調製的連續光激發樣品，測量得到的是具有相同頻率的熒光信號，但由於(yu) 熒光壽命的影響，熒光信號的振幅和相位相比激發光均發生了變化，因此通過計算熒光信號相對激發光的振幅調製度變化和相位延遲可計算得到熒光壽命。時域法則需要采用高重複頻率的飛秒脈衝(chong) 激光激發樣品，利用前麵提到的門控技術、掃描相機或 tcspc 技術等直接或間接記錄脈衝(chong) 過後的熒光衰減過程，得到的是熒光強度（或光子數）隨時間的變化關(guan) 係，因此一般可通過曲線擬合得到熒光壽命。
PA法先被用於(yu) 處理頻域FLIM技術得到的熒光壽命數據，其相量由頻域FLIM測量得到的解調係數和相位延遲來構建，是原始數據的直接表達。PA法同樣適用於(yu) 時域FLIM數據的分析，但需要先將時域的熒光衰減變換到頻域。由 於(yu) 時域FLIM中的TCSPC-FLIM目前国产成人在线观看免费网站廣泛，因此 PA 法在該技術中的應 用也是報道得較多的。以下分別介紹這兩(liang) 類技術中PA法分析熒光壽命的基本原理，並結合熒光相量圖的特點闡述其典型的国产成人在线观看免费网站思路。
通過求解係統信號相移和解調係數，然後會(hui) 求解壽命, 即:
其中 fi 為(wei) 第 i 個(ge) 調製頻率測得的光強占總光強的比例.
利用相量的概念對頻域法 FLIM 得到的數據進行幾何表示,他們(men) 利用單個(ge) 像素點對應的解調係數M和相移f來構建一個(ge) 相量,即以M作為(wei) 該相量的模,以f作為(wei) 該相量的輻角,則可以認為(wei) 相量與(yu) 像素點是一一對應的,相量圖上一個(ge) 相量的端點就代表了一個(ge) 像素點的全部熒光壽命信息 (如圖1(b) 所示).該相量在實軸和虛軸的分量可用 Weber 符號表示, 即:
對於(yu) 單指數衰減情形, 可得到 cosf=M, 因此可以得到:
即以坐標(G, S)表示的相量端點被約束在原心位於(yu) (0.5, 0)處、半徑為(wei) 0.5 的半圓上。半圓上的每個(ge) 點表示不同的壽命，其壽命值從(cong) 左到右遞減，其中(1, 0)表示接近零的壽命，(0, 0)表示無限長的壽命，如圖 1(b)所示。則根據衰減組分間的線性疊加性質，其在相量圖上對應的相量端點應位於(yu) 半圓以內(nei) ，即多指數衰減過程對應的 G 和 S 應為(wei) ：
幾何意義(yi) 上，多指數衰減過程對應的相量端點應位於(yu) 其各個(ge) 單指數衰減組分對應的壽命相量端點連接組成的集合內(nei) 。如圖 1(c)中，雙指數衰減過程對應的壽命相量端點（藍色）落在半圓以內(nei) ，位於(yu) 兩(liang) 個(ge) 單指數衰減組分對應的壽命相量端點（綠色）的連線上，且與(yu) 兩(liang) 端點的距離（p1、p2）由兩(liang) 個(ge) 組分的占比（α1、α2）決(jue) 定。
PA 法同樣適用於(yu) 時域法 FLIM 數據的分析。這裏以目前国产成人在线观看免费网站廣泛的TCSPC-FLIM 技術為(wei) 例。如圖 1(d)所示，TCSPC 將每一次脈衝(chong) 信號作為(wei) 一個(ge) 信號周期，每個(ge) 周期內(nei) 當探測到第①個(ge) 熒光光子時就在其到達時間對應的時間通道中進行計數，經過多次累積即可建立一個(ge) 反映熒光衰減過程的光子數-時間分布直方圖，用於(yu) 求解熒光壽命。
圖1 熒光壽命的測量方法及相量分析 (PA) 法示意圖 (a) 頻域法測量原理示意圖; (b) 單指數衰減的壽命相量示例圖; (c) 雙指數衰減的壽命相量示例圖; (d) 時間相關(guan) 單光子計數 (TCSPC) 測量原理示意圖
三． 實驗過程
3.1 SwissSPAD2技術概述
本文使用的探測器是SwissSPAD2 (SS2)，這是一種高速、大尺寸SPAD成像傳(chuan) 感器，時間門集成在同一芯片上。該傳(chuan) 感器芯片由512×512像素組成，在這裏測試的相機模塊中，隻有472×256像素被啟用。像素間距為(wei) 16.38μm，相鄰像素之間的串擾概率小於(yu) 0.075%。由於(yu) 每個(ge) 像素的數字化特性(一個(ge) 光子被檢測，或沒有)，相機捕獲二進製圖像，理想情況下是沒有讀出噪聲的，使其適合單光子成像。每個(ge) 像素有一個(ge) 1位的存儲(chu) 電子器件，整個(ge) 陣列以較高97.7kfps(每秒千幀)的速度被讀取。每255個(ge) 二進製幀序列在現場可編程門陣列(FPGA)上累積成8位門圖像，通過USB3.0連接傳(chuan) 輸到PC機的數據采集存儲(chu) 器。更詳細的SS2技術規格可以聯係我們(men) 進一步溝通。
SS2使用其像素門電子技術進行時間分辨成像。使用FPGA上的混合模式時鍾管理器(MMCM)模塊，從(cong) 激光控製器(或快速激光拾取PIN二極管)傳(chuan) 輸到相機的激光觸發信號產(chan) 生全局(陣列範圍)門信號。簡單地說，在每個(ge) 1位的幀曝光期間(用戶可選擇Z大400ns，Z小50ns的倍數)，在每個(ge) 激光脈衝(chong) 之後，門被打開或關(guan) 閉，任何檢測到的光子都將像素存儲(chu) 設置為(wei) 1。如果檢測到多個(ge) 光子，則忽略後續的光子。在設定曝光時間之後，讀出1位幀，並重複該過程，直到獲得用戶定義(yi) 的幀總數(8位門圖像通常為(wei) 255，或10位門圖像為(wei) 4×255)。然後將積累的門圖像傳(chuan) 輸到PC，同時定義(yi) 一個(ge) 新的門位置，並重複這個(ge) 過程以獲得一個(ge) 新的門圖像，以此類推，直到獲得所需數量的門圖像。
SS2的柵極持續時間W比大多數常見的熒光團壽命要長得多(10 ns)，但相對於(yu) 激光脈衝(chong) ，可以非常精確地觸發，步驟為(wei) 17.9 ps。圖2說明了典型柵極窗口的特征。通過記錄探測器對20MHz脈衝(chong) 激光的響應，在50ns激光周期內(nei) ，利用階躍17.9 ps的門圖像，測量了該門曲線。圖中顯示了一個(ge) 跨度為(wei) 70納秒的窗口，但柵極剖麵的周期為(wei) 50納秒。
圖2所示 FLIM實驗中使用的柵極特性。在中心472×256數組中每隔4個(ge) 像素的響應被繪製出來。Z小可達到的柵長為(wei) 10.8 ns
測試了七種柵極長度W在10.8 ns ~ 22.8 ns之間的柵極構型。門的長度和位置決(jue) 定了SPAD在每次激光脈衝(chong) 後的敏感時間窗。在固定的激光頻率和強度下，較寬的光柵可以在給定的曝光時間內(nei) 收集更多的光子，但代價(jia) 是較低的光子到達時間分辨率。正如我們(men) 將看到的，這不是一個(ge) 基本的極限。該軟件允許選擇門配置(長度)，每1位幀的激光脈衝(chong) 數(曝光)，每個(ge) 門圖像的位深度(8或10位)(動態範圍)，兩(liang) 個(ge) 連續門位置之間的延遲(步長)，以及數據集中門圖像的數量。
柵極特性影響時間分辨成像性能，影響熒光壽命測定的準確性和精密度。對於(yu) 大視場係統，測量的空間均勻性是由柵邊位置分布或傾(qing) 斜決(jue) 定的。在大尺寸傳(chuan) 感器中，門信號的傾(qing) 斜和高頻信號切換期間可能的電壓下降導致陣列的門邊緣非均勻性。隨著柵極長度的增加，上升邊緣傾(qing) 斜明顯縮小(在表1的Z後一行旁邊)。這種效應可以歸因於(yu) 信號轉換期間電源電壓波動水平的差異。第①門信號躍遷(對應於(yu) 大門的下降沿窗口自門推進對激光觸發)導致門信號下降空間電源電壓不平衡樹,結果在第②斜門信號轉變,在這種情況下,上升的邊緣。隨著柵極長度的增加，在較長的過渡延遲期間，電壓降的較好的恢複降低了歪斜。由於(yu) 柵門不均勻性的來源是確定的，它可以通過測量後的校準校正，如下一節所述。
閘門性能的另外兩(liang) 個(ge) 關(guan) 鍵參數是上升和下降時間。它們(men) 的主要影響因素是激光脈衝(chong) 寬度、SPAD響應、門信號抖動以及門晶體(ti) 管的開關(guan) 速度。後者是由製造工藝約束決(jue) 定的。由於(yu) 電源電壓擺幅隨這些參數的變化，柵邊的陡度也取決(jue) 於(yu) 讀出速度和激光頻率。因此，時間分辨率受到一係列隨機效應的影響，其中一些我們(men) 無法控製，因此在這項工作中沒有研究它們(men) 的影響。
SS2 10.5%的原生填充因子可以通過微透鏡進行部分補償(chang) 。此次實驗描述了，使用兩(liang) 個(ge) SS2相機(一個(ge) 有微鏡頭，一個(ge) 沒有微鏡頭)，使用相同的相機曝光和照度設置，連續拍攝convallaria majalis樣本圖像。濃度因子(CF)定義(yi) 為(wei) μm/μnm的比值，其中μm和μnm分別為(wei) 有微透鏡和無微透鏡相機的平均光子數減去探測器暗計數後的CF=2.65，對應的有效填充因子為(wei) 27.8%。
由於(yu) 這一濃度因子低於(yu) 理論計算值，我們(men) 在一個(ge) 簡單的光學裝置上測試了這兩(liang) 個(ge) 傳(chuan) 感器，其中傳(chuan) 感器和準直激光束(785nm, PiLas, a.l.s.，德國)之間的角度可以在兩(liang) 個(ge) 維度上進行調整。對兩(liang) 種傳(chuan) 感器進行了連續測試，測量出總光子數隨入射角的變化。通過該方法計算得到，在3.5 V剩餘(yu) 偏置電壓下，較佳角度下的Z大濃度因子為(wei) 4.46。這種與(yu) 正常入射CF的差異可能是由於(yu) 微透鏡陣列相對於(yu) SPAD陣列的輕微錯位或微透鏡特性的局部變化造成的。
表1總結了SS2的性能，並將其與(yu) 其他的大畫幅科學相機進行了比較。SPAD相機由於(yu) 其數字特性，理想的讀出噪聲為(wei) 零，因此它們(men) 可以用單光子靈敏度執行廣域FLIM。與(yu) MCPs和基於(yu) 光電陰極的探測器相比，他們(men) 的cmos技術是可擴展的，健壯的和經濟的。在SPAD相機中，SS2采用了迄今為(wei) 止較大的陣列尺寸，既能實現寬視場，又能實現高空間分辨率。
表1 參數列表
3.2 設備介紹
SPAD5122是一個(ge) 512×512像素的單光子雪崩二極管圖像傳(chuan) 感器。它可以使光子計數達到每秒10萬(wan) 幀，讀出噪聲為(wei) 零。 Global shut可以實現納秒級曝光，曝光偏移為(wei) 18 ps。該陣列優(you) 化為(wei) 低噪聲，典型的暗計數率小於(yu) 25 cps。
表2 SPAD5122參數
圖3 PDP 特性曲線
外觀以及通訊接口：
3.3 影響數據的因素處理
獲得的數據需要通過堆積校正，背景校正，降低噪聲等手段獲得理想的信息。由於(yu) 攝像機存儲(chu) 方案，記錄的信號不會(hui) 與(yu) 入射信號線性縮放。雖然這種校正方法有助於(yu) 恢複入射衰減剖麵，但堆積能顯著降低信噪比(SNR)。在計算相量時，必須考慮由探測器噪聲引起的不相關(guan) 背景信號。背景不相關(guan) 有多重效應。雖然這些方法不能減輕背景光子引起的色散的輕微增加，但它們(men) 改善了計算相量的位置和隨後的分析。由於(yu) 製造過程的不完善，陣列中有一小部分SPADs具有高暗計數率。所以可以設置一些感興(xing) 趣的關(guan) 注點，對於(yu) 感興(xing) 趣區域或ROI進行數據處理，而不是單個(ge) 像素值進行分析，此時暗計數對計算出的ROI相量的影響減小，因此在大多數情況下可以忽略。
3.4 時間門控數據相量分析
3.4.1 相量校準
在實際国产成人在线观看免费网站中，實驗門的形狀和激光脈衝(chong) 與(yu) 觸發信號之間的時間延遲(偏置)都會(hui) 影響采集硬件記錄的衰減的形狀，衰減是采樣信號與(yu) 儀(yi) 器響應函數(IRF)的卷積。使用已知壽命
的校準樣本，可以很容易地校正IRF的效應。在相量表示中，IRF的存在隻是對理論相量的模量進行縮放，並將其相量旋轉一個(ge) 固定的量(樣本相量乘以IRF相量)。
利用定標樣品的理論相量
可以測量定標樣品的未校正相量
得到紅外光譜相量。
圖4 相量法的概念說明 (a)固定寬度W的柵極在50 ns熒光衰減周期內(nei) 被掃描。每個(ge) 柵極與(yu) 一個(ge) 納米時間相關(guan) 聯，指定其相對於(yu) 激光脈衝(chong) 的開始時間。門圖像中的每個(ge) 像素包含在門口發現的光子數圖像曝光時間。(b)的相量衰變(P)記錄在給定像素的加權平均計算門圖像強度乘以一個(ge) 餘(yu) 弦或正弦項根據門時間)
事實上，相同的校準方法通常可以很好地糾正由門控過程帶來的衰減修正，這相當於(yu) 一個(ge) 積分，而不是卷積：
其中
是一個(ge) 校準因子，結合了IRF和Gate對記錄的衰減的影響。式(8)在本工作中所研究的所有情況下都能令人滿意地工作，隻要門數G不太小（實際G>10）。
校準因子
可以為(wei) 每個(ge) 像素(使用相量校準圖像)，或為(wei) 每個(ge) ROI(使用相量校準地圖)，或為(wei) 整個(ge) 幀全局(單相量校準)計算。在本研究中，由於(yu) 柵極特性，我們(men) 計算了覆蓋整個(ge) 視場的連續4×4像素ROIs的校準因子。
四． 結果：
4.1 SS2時間門控數據記錄
圖5 (a)ATTO 550，(b)Cy3B， (c)羅丹明6G(R6G)，和(d)量子點(QD585)溶液的門強度曲線(坐標(193,190))。參數:激光頻率:20 MHz，門寬W = 13.1 ns，位深:10，背景校正:off。藍色:無堆積修正，紅色:堆積修正。
圖5顯示了本文各種實驗中使用的四種市售熒光樣品的熒光衰減譜，由SS2用W = 13.1 ns柵極寬度和17.86 ps柵極步長(總共2800個(ge) 柵極)記錄。ATTO 550, Cy3B和羅達明6G (R6G)樣品(圖5(a) (c))是水溶液夾在由1mm厚橡膠墊圈隔開的兩(liang) 個(ge) 玻璃覆蓋物之間，允許測試探測器的寬場響應均勻性。這些樣本還被用於(yu) 研究相量分析性能對各種采集參數的依賴性，如後麵一節所述。圖5(d)顯示了水量子點(QD)樣品(Qdot585 Streptavidin, ThermoFisher Scientific, 1 μM)在玻璃覆蓋層上晾幹後的衰減剖麵，導致了隨機的不均勻密度模式，其特征是視場的平均相壽命不同，稍後將討論。三種染料溶液的濃度不同(水緩衝(chong) 液的濃度為(wei) 10nM-1μM)， ATTO 550的濃度Z低，導致明顯的顆粒噪聲，而較亮的樣品R6G的影響Z小。這一變化為(wei) 研究光子計數對壽命測定性能的影響提供了機會(hui) 。
4.2 SS2數據相量分析
SS2的相量分析的結果與(yu) 測量數據如圖6所示的三個(ge) 熒光染料與(yu) 類似的激發和發射光譜(吸收峰約550nm,發射峰周圍570nm),但不同的一生:Cy3B R6G和阿550(文獻值:τ= 2.8 ns,分別4.08 ns和3.6 ns)。在實驗中，用脈衝(chong) 寬度為(wei) 100 ps的532 nm 20 MHz脈衝(chong) 激光器(LDH-P-FA-530XL, PicoQuant，德國)激發所有染料溶液。選擇ATTO 550作為(wei) 中間壽命物種，計算一個(ge) 分置(4 4)校準圖，用於(yu) 校準其他兩(liang) 種染料樣品(Cy3B &R6G)，在方法中解釋。ATTO 550、Cy3B和R6G具有相似的光物理性質，但在532 nm激發時，R6G比其他兩(liang) 種光略亮(比Cy3B亮兩(liang) 倍，比ATTO 550亮三倍)。此外，由於(yu) ATTO 550樣品的濃度低於(yu) 另外兩(liang) 個(ge) 樣品，我們(men) 用較大的積分時間對其較低的信號進行補償(chang) (另外兩(liang) 個(ge) 樣品用10位數據代替8位數據)。計算的相位散點圖。
圖6(a)-(c)分別表示2800、140和16個(ge) 柵極位置計算的相量散點圖。由於(yu) 總信號的減少，相量色散明顯地隨著門數的減少而增加。然而，這兩(liang) 個(ge) 物種仍然可以通過16門來分辨，有效幀率為(wei) 12.1 fps，這表明對於(yu) 這些壽命差異為(wei) 1.4 ns的特定樣本，在實時采集速度下可以對相量圖上的染料進行識別。
相量值可以轉換為(wei) 相位壽命值(使用公式(5))，從(cong) 而得到具有平均值和標準差的正態分布，如表2所示。與(yu) 文獻值相比，測量的壽命顯示了輕微的負偏置(Cy3B為(wei) 300 ps或10%，R6G為(wei) 200 ps或5%)，但與(yu) 使用配備不同脈衝(chong) 激光源的共聚焦TCSPC裝置測量的結果相匹配(數據未顯示)。它們(men) 的標準偏差尺度為(wei) g-1 /2，其中G是用於(yu) 計算的門的數量，就像預期的射擊噪聲限製信號(公式(12))，因為(wei) 計數的數量與(yu) 用於(yu) 分析的門的數量成比例。
圖6 R6G(τ = 4.08 ns)和Cy3B (τ=2.8ns)在2,800 (a)、140 (b)和16 (c)門位置得到的解的相量散點圖，並使用對應的ATTO 550數據集(τ= 3.6 ns)校準。當使用更少的門(因此也就更少的光子)時，兩(liang) 個(ge) 樣品相量的視覺分離變得更具挑戰性。即使隻有16個(ge) 柵極，這兩(liang) 個(ge) 樣本也能明顯區分開來。實驗參數:激光和相量頻率:20 MHz，門寬:13.1 ns，陣列尺寸:472 256，箱數:4 4，位深:8 (R6G &Cy3B)，16 (ATTO 550)，堆積校正:開啟，背景校正:開啟，移除像素百分比:0% (R6G &Cy3B)，0.5% (atto550)
表3。從(cong) 圖6中得到的相位壽命和標準偏差(以ns為(wei) 單位)。測得的相壽命略短於(yu) 文獻值(Cy3B: 2.8 ns, R6G: 4.08 ns)，公式(12)的標準差為(wei) g-1 /2。
4.3複雜樣本的階段生命周期圖
相量法的一個(ge) 強大的方麵是它在相量圖中對樣本壽命的二維表示。物種的特征是一個(ge) 指數衰減與(yu) τ一生都位於(yu) 一個(ge) 定義(yi) 良好的地區接近通用圓(加州大學),很容易區分與(yu) 不同時間的樣品(見例如圖6)。一個(ge) 示例包括兩(liang) 個(ge) 熒光物種不同壽命局部獨立的地區在圖像中，相量圖將在相量圖中顯示兩(liang) 個(ge) 單獨的相量簇。然後簡單關(guan) 聯的位置相量的相量圖和相應的位置在圖像來源,例如紅色和綠色都表示測量出了不同壽命值。在任何其他情況下(例如，當不同的物種具有不同的生存期，但在圖像中集中)，相量將是中間的，並且就生存期而言的解釋更加微妙，但仍然可以使用類似的和有用的顏色映射，如下所示。
說明這個(ge) 實用方麵的相量圖SS2特定情況下的傳(chuan) 感器,我們(men) 研究的樣本一樣商業(ye) 量子點發射光譜範圍前麵所討論的有機染料樣品(Qdot 585鏈黴親(qin) 和素,峰值發射波長:585nm),但是更長的壽命(參見圖5 (d))。量子點(QDs)除了具有較長的壽命外，通常還表現出尺寸上的多分散性，這導致其光物理性質(如發射光譜峰值、壽命等)的異質性，這也取決(jue) 於(yu) 其所處的環境。
將該QD樣品的10μl原液(濃度為(wei) 1μM)放在蓋玻片上晾幹，並使用與(yu) 之前測量相同的設置在環境條件下成像。對應的強度圖像如圖7(a)所示，其特征是高QD濃度的明亮隨機條紋，點綴著低濃度的區域(條紋和幹燥的微滴區域)。該圖像中每個(ge) 像素的相量(使用前一節描述的Cy3B樣本校準)表示為(wei) 圖7(d)所示的二維直方圖。相位壽命τR = 13.9 ns和τG = 16.7 ns均較接近UC，並沿紅點和綠點排列。使用每個(ge) 相量與(yu) 這兩(liang) 個(ge) 參考點的相對距離(或相量比rG，公式(16))對源圖像中的原始像素進行顏色編碼(rG = 0:紅色，rG = 1:圖7(b))所示的藍色，中間光譜顏色比例圖，產(chan) 生圖7(b)所示的相量圖，其中每個(ge) 像素的顏色對應於(yu) 其相量比。
將該QD樣品的10μl原液(濃度為(wei) 1μM)放在蓋玻片上晾幹，並使用與(yu) 之前測量相同的設置在環境條件下成像。對應的強度圖像如圖7(a)所示，其特征是高QD濃度的明亮隨機條紋，點綴著低濃度的區域(條紋和幹燥的微滴區域)。該圖像中每個(ge) 像素的相量(使用前一節描述的Cy3B樣本校準)表示為(wei) 圖7(d)所示的二維直方圖。相位壽命τR = 13.9 ns和τG = 16.7 ns均較接近UC，並沿紅點和綠點排列。使用每個(ge) 相量與(yu) 這兩(liang) 個(ge) 參考點的相對距離(或相量比rG，公式(16))對源圖像中的原始像素進行顏色編碼(rG = 0:紅色，rG = 1:圖7(b))所示的藍色，中間光譜顏色比例圖，產(chan) 生圖7(b)所示的相量圖，其中每個(ge) 像素的顏色對應於(yu) 其相量比。
圖7 QD階段生命周期圖。(a):幹燥QD樣品的強度圖像。對比度已經調整，可以看到大部分的視野。比例尺為(wei) 25 μm。(b)，(c):用顏色編碼的階段壽命圖。兩(liang) 個(ge) 引用(綠點:16.7 ns和紅點:13.9 ns)定義(yi) 的相量圖(d)所示。像素顏色根據他們(men) 的相量比這兩(liang) 個(ge) 引用和使用b。像素的光譜顏色規模表示相量接近第①個(ge) 參考(綠點:較長的生命周期)被標記為(wei) 藍色，而相量接近第②個(ge) 參考點的像素(紅點:較短的生命周期)被標記為(wei) 紅色。像素與(yu) 相量之間的顏色與(yu) 一個(ge) 中間顏色。線段外的點根據線段上Z近的點著色。細長的六邊形代表相量圖區域的邊界，適用於(yu) 這種顏色編碼方案。在b中，對所有像素保持相同的亮度，不管它們(men) 的實際強度，允許顯示低強度像素(和它們(men) 的相位壽命)。壽命與(yu) 強度之間沒有明顯的相關(guan) 性，而濃度與(yu) 壽命之間似乎存在相關(guan) 性。(d):底部:a所示數據的相量圖。頂部:底部相量圖所選方形區域的細節。兩(liang) 個(ge) 參考點(綠點和紅點)在相量雲(yun) 的兩(liang) 端都可見。
五． 討論
在這項工作中，我們(men) 研究了一種新的寬視場時間門控SPAD陣列的FLIM使用相量方法的性能。在該傳(chuan) 感器中，我們(men) 實現了相對較長的時間門。這種設計選擇與(yu) 大多數時間門控檢測器不同，它需要降低每個(ge) 像素的間距並將陣列放大到較大的格式，而時間門控檢測器則力求實現盡可能短的門控持續時間，以模擬TCSPC技術的性能。此外，每個(ge) 像素的數據內(nei) 容為(wei) 1位，對應於(yu) 每個(ge) 讀出周期的光子計數為(wei) 1或0。傳(chuan) 感器的這種特性導致需要在像素級進行堆積校正。
大視場時分辨成像係統的整體(ti) 性能可以用兩(liang) 種不同的方式來定義(yi) 。第①種方法是找到所需的時間，以給定的精度確定一個(ge) 固定像素區域的生命周期，對照明級別沒有限製。該參數由減少的光子經濟(由測量壽命或f值上的歸一化相對誤差表示，公式(9))和Z大本地光子計數率決(jue) 定。然而，在某些情況下，可接受的照明水平是有限製的。在發射強度在探測器動態範圍內(nei) 的情況下，係統的性能由像素的靈敏度和光子效率決(jue) 定。要定義(yi) SS2的當前和潛在功能，必須很好地理解每個(ge) 參數的限製。
根據定義(yi) ，Z大局部計數率是兩(liang) 個(ge) 可探測光子之間的Z小延遲的倒數。在SS2的全局快門模式下，由於(yu) 像素內(nei) 存儲(chu) 器隻能存儲(chu) 一個(ge) 光子，所以這個(ge) 延遲等於(yu) 曝光和讀出時間的總和。如果SPAD在一幀中檢測到一個(ge) 以上的光子，那麽(me) 除了第①個(ge) 光子外，所有的光子都會(hui) 被錯過。這種現象被稱為(wei) 堆積，會(hui) 導致熒光衰減形狀的扭曲。這裏使用的堆積校正(式(1))部分恢複了光子分布;然而，它不能改善由於(yu) 光子丟(diu) 失而引起的信噪比下降。為(wei) 了減少堆積，所有門的每幀平均光子數必須保持在1以下。為(wei) 了計算Z大局部計數率，可接受堆積的Z大允許光子計數必須乘以門響應的平均強度和峰值強度的比值，該比值受樣品壽命門長度和激光脈衝(chong) 寬度的影響。增加像素內(nei) 存儲(chu) 器的位深度或讀取速度是增加Z大計數率的兩(liang) 種可能方法，代價(jia) 是增加後脈衝(chong) (這將顯示為(wei) FLIM pur姿態的背景噪聲)。這兩(liang) 種解決(jue) 方案都需要額外的芯片麵積，因此它們(men) 會(hui) 帶來填充因子的損失或像素大小的增加。
該成像儀(yi) 的靈敏度由SPAD的光子探測效率和像素死區時間決(jue) 定。PDE是SPAD檢測到的入射光子的百分比，等於(yu) PDP和填充因子的乘積。為(wei) 了改善偏微分方程，在成像儀(yi) 上沉積了微透鏡。SS2上微透鏡的濃度因子在2.6 (Vex = 6.5 V)到4.5 (Vex = 3.5 V)之間，有效填充因子在28%到47%之間。死時間是傳(chuan) 感器操作期間對光子不敏感的時間。SS2在低堆積狀態下工作時，死區時間包括全局快門模式下的讀出時間和柵門關(guan) 閉時激光周期的持續時間。第①個(ge) 問題可以通過切換到卷簾模式來解決(jue) ，在這種模式下曝光和讀數同時發生。對於(yu) 目前的芯片版本，此操作需要對配電網進行改進。第②個(ge) 問題可以通過向像素添加第②個(ge) 門來解決(jue) 。這種雙柵結構使像素在整個(ge) 激光周期內(nei) 都是敏感的，同時通過將光子分配到兩(liang) 個(ge) 門中的一個(ge) 來記錄時間信息。有了這兩(liang) 個(ge) 附加條件，死時間就可以幾乎消除了。
六． 總結
在接近視頻速率(12.4 fps，圖7(b))的情況下，實現良好的壽命精度和高精度(140 ps)的能力是實時FLIM的一個(ge) 令人鼓舞的裏程碑。為(wei) 了充分實現這一目標，下一步將涉及到FPGA上實現相量計算，實現高吞吐量的數據處理。複雜混合物中物種組分的提取也是flam - fret測量的重要一步。提高靈敏度，實時時間門控成像和多物種量化的結合將擴展該傳(chuan) 感器的能力，以滿足高速和高精度的国产成人在线观看免费网站，如小動物成像。
Admesy 不僅(jin) 在亮度，色度，光譜方麵為(wei) 大家提供了解決(jue) 方案，並且也提供了測量Flicker閃爍值的解決(jue) 方案。歡迎大家來電谘詢。
您可以通過我們(men) 昊量光電的官方網站www.weilancj.com了解更多的国产欧美在线信息，或直接來電谘詢4006-888-532，我們(men) 將竭誠為(wei) 您服務。
展示全部 
