活體(ti) 組織中細胞和細胞器的長時間高時空分辨率監測對理解其生理現象具有重要意義(yi) ，但是組織特殊的光學屬性使得長時間高時空分辨率監測非常困難。細胞的離體(ti) 觀察難以反映其在體(ti) 內(nei) 的真實生物動態，例如腫瘤細胞在體(ti) 外很容易被殺死，而在活體(ti) 環境時，受到三維組織以及各種細胞因子的影響，想要殺死腫瘤細胞就變得沒那麽(me) 容易。這個(ge) 時候，就需要有效的三維活體(ti) 成像手段來替代二維的體(ti) 外研究。細胞之間以及細胞內(nei) 的活動往往需要高時空分辨率的手段來應對，特別是哺乳動物，心跳和呼吸會(hui) 在沒有高成像速率的情況下引入運動模糊和偽(wei) 影。組織中折射率的不均勻分布會(hui) 導致嚴(yan) 重的光學像差，從(cong) 而降低圖像分辨率和信噪比(SNR)。強光劑量會(hui) 幹擾正常的細胞行為(wei) 和細胞器功能，導致活體(ti) 成像的光子劑量有限，即信噪比低，時間分辨率也會(hui) 下降。
2021 cell:數字自適應光學迭代層析用於(yu) 三維活體(ti) 亞(ya) 細胞毫秒級動態小時級觀測
技術背景：
活體(ti) 組織中細胞和細胞器的長時間高時空分辨率監測對理解其生理現象具有重要意義(yi) ，但是組織特殊的光學屬性使得長時間高時空分辨率監測非常困難。細胞的離體(ti) 觀察難以反映其在體(ti) 內(nei) 的真實生物動態，例如腫瘤細胞在體(ti) 外很容易被殺死，而在活體(ti) 環境時，受到三維組織以及各種細胞因子的影響，想要殺死腫瘤細胞就變得沒那麽(me) 容易。這個(ge) 時候，就需要有效的三維活體(ti) 成像手段來替代二維的體(ti) 外研究。細胞之間以及細胞內(nei) 的活動往往需要高時空分辨率的手段來應對，特別是哺乳動物，心跳和呼吸會(hui) 在沒有高成像速率的情況下引入運動模糊和偽(wei) 影。組織中折射率的不均勻分布會(hui) 導致嚴(yan) 重的光學像差，從(cong) 而降低圖像分辨率和信噪比(SNR)。強光劑量會(hui) 幹擾正常的細胞行為(wei) 和細胞器功能，導致活體(ti) 成像的光子劑量有限，即信噪比低，時間分辨率也會(hui) 下降。為(wei) 了解決(jue) 組織長時間高時空分辨率監測非常困難的問題，研究人員開發出了各種各種的技術手段。過去的十年中，亞(ya) 細胞活體(ti) 顯微鏡有了大幅的發展，例如轉盤共聚焦顯微鏡、自適應光學 (AO)、高速雙光子顯微鏡和光片顯微鏡 (LSM)，它們(men) 與(yu) 新的動物模型一起促進了神經科學、發育生物學、免疫學和癌症生物學領域的各種研究。然而，在分辨率、速度、SNR 和樣本健康之間存在難以躲避的矛盾，這在實時熒光成像中被稱為(wei) “挫折金字塔(pyramid of frustration)”。在通常需要對多個(ge) 平麵進行軸向掃描的三維 (3D) 生物體(ti) 中，情況變得更糟。一次實驗的時間窗口隻能支持數百個(ge) 體(ti) 積采集，以避免總光劑量超過 300 J/cm2 從(cong) 而造成相當大的光損傷(shang) 。 LSM 通過僅(jin) 激發對焦區域以避免不必要的曝光來緩解該問題。帶有 AO 的晶格 LSM進一步提高了透明生物體(ti) 的時空分辨率，但小視野 (FOV) 和 AO 校正都限製了其大體(ti) 積觀測時的速度。此外，由於(yu) 組織不透明和空間限製，很難以亞(ya) 細胞分辨率在哺乳動物組織中国产成人在线观看免费网站 LSM。在哺乳動物中以亞(ya) 細胞分辨率和低光子劑量進行長期、高速成像仍然是一個(ge) 挑戰。在各種體(ti) 積成像手段中，光場顯微鏡能夠實現高速三維成像。
當前不足：
三維組織成像、像差校正、光毒性是當前活體(ti) 成像的三大難題。光場顯微鏡雖然具有高速三維成像能力，但是受到海森堡不確定性原理的限製，其空間分辨率與(yu) 角度分辨率是一對矛盾量，無法同時獲得高空間分辨率和角度分辨率。
文章創新點：
基於(yu) 此，清華大學的Jiamin Wu(第1作者)和Qionghai Dai(通訊作者)等人受果蠅複眼和攝影中亞(ya) 像素偏移手段的啟發，提出了一種數字自適應掃描光場交互迭代層析顯微鏡(digital adaptive optical scanning light field mutual iterative tomography, DAOSLIMIT)技術。其具有高速、高分辨率 3D 成像、自適應光學像差校正和低光毒性的優(you) 勢。可實現 225 X 225 X 16 um3 的體(ti) 積成像，橫向分辨率高達 220 nm，軸向分辨率高達 400 nm，時間分辨率達毫秒級，觀測時長可達小時級。作者研究了不同物種的大規模細胞遷移和神經活動，並觀察了哺乳動物在中性粒細胞遷移和腫瘤細胞循環過程中的各種亞(ya) 細胞動力學。
（1） 開發了一種緊湊的掃描光場顯微鏡係統，該係統利用圖像平麵的周期性漂移收集高分辨率的四維空間-角度信息(二維在角度域，二維在空域)，實現衍射極限分辨率圖像重建。
（2） 提出數字自適應光學像差校正方法，應對組織成像中存在光學像差的問題。利用掃描光場顯微鏡不同角度測量之間的差異估計像差，然後通過數字平移角度圖像校正像差。相比傳(chuan) 統的自適應光學，不需要波前傳(chuan) 感器或空間光調製器。
原理解析：
（1）利用小尺寸微透鏡的衍射效應，借鑒疊層成像的原理，通過二維振鏡周期性的掃描像平麵，以犧牲時間分辨率為(wei) 代價(jia) ，同時獲得高的空間分辨率和角度分辨率。如圖1A和C所示。
（2）如圖1B和C，不同分割孔徑上的線性相位調製對應角度分量的空間平移，使得不僅(jin) 可以從(cong) 角度測量之間的不一致估計空間非均勻像差，也可以通過數字平移角度圖像來校正像差。這一過程稱為(wei) 數字自適應光學(DAO)。交互迭代層析算法基於(yu) ADMM，集成了迭代波前估計和拚接像差(tiLED aberration)校正後體(ti) 積重建，可以提高複雜場景成像的分辨率和信噪比。（3）利用具有時間加權和時間循環的時空平滑先驗算法，緩解由運動偽(wei) 影和掃描引起的成像速度下降問題。DAOSLIMIT提供了時空域的一個(ge) 周期性的稀疏采樣模式。如圖1E，對於(yu) 每一個(ge) 角度分量，在一個(ge) 掃描周期內(nei) 的局部時空域做反距離加權(這在地理學中經常使用)。通過一個(ge) 滑行窗口的交錯重建(interleaved reconstruction)，可以得到高分辨率的延時角度分量，幀率高至相機幀，且沒有運動偽(wei) 影，這種算法稱為(wei) 時間加權算法，如圖1F所示。時間循環算法被開發用於(yu) 視頻重建，以加速收斂。通過對以不同的速度移動的樣品成像，驗證了算法的有效性，速度可高至55像素/幀，甚至非均勻運動也適用。
視頻1：原理示意及實拍效果
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