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光學顯微鏡中生物細胞的溫度控製麵臨的挑戰和解決方案

發布時間:2022-05-18 16:29:32 瀏覽量:4846 作者:Enna

摘要

溫度的變化對化學反應速率和生物機理都會(hui) 產(chan) 生影響,如何精準地控製“實驗溫度”以及研究不同溫度下的實驗樣本狀態尤為(wei) 重要。傳(chuan) 統的生物顯微熱台等生物溫度控製器麵臨(lin) 溫漂、精度低、溫控速率慢等問題, 因此,Interherence国产黄色在线观看利用 VAHEAT 實現了高分辨率顯微鏡下對生物細胞精確的動態溫度控製。“VAHEAT”溫度控製係統操作簡單,溫度可以以高達每秒 100°C 的速率變化,穩定誤差低於(yu) 0.1°C ,VAHEAT適配於(yu) 各種顯微鏡,內(nei) 置加熱模塊和溫度傳(chuan) 感模塊,可對區域內(nei) 溫度進行快速和精確調整,同時具備恒溫加熱、動態加熱、熱衝(chong) 擊和自定義(yi) 四種加熱模式,常用於(yu) 在生命科學和材料研究中對溫度敏感的過程相關(guan) 研究。


正文


光學顯微鏡中生物細胞的溫度控製麵

臨(lin) 的挑戰和解決(jue) 方案


眾(zhong) 所周知,溫度的變化對化學反應速率和生物機理都會(hui) 產(chan) 生影響,如何精準地控製“實驗溫度”以及研究不同溫度下的實驗樣本狀態尤為(wei) 重要。因此,我們(men) 從(cong) 成像樣品溫度控製麵臨(lin) 的常見問題出發,致力於(yu) 實現對顯微鏡視野中的溫度進行高靈敏度的熱控製,由此獲得更嚴(yan) 謹可靠且可重複的數據。


圖1:VAHEAT係列溫度控製器


一、顯微鏡中溫度控製問題:

1.液體(ti) 樣品蒸發 - 介質濃度變化,在較冷表麵凝結;

2.溫度漂移;

3.溫度範圍有限(z大 45–55°C),標準控製係統中無法實現快速溫度變化;

4.在較高溫度下圖像質量下降或 TIRF 角度損失;

5.某些設置的複雜性——多個(ge) 反饋回路,需要特定的溫度校準;

6.不同的溫度和整個(ge) 視場溫度梯度 - 作為(wei) 散熱片的浸泡物鏡


圖 2:a) 使用 63x/1.4 NA 油浸物鏡時的散熱效果表征。平衡至 37°C 的大型環境室不足以將樣品保持在 37°C。當浸入式物鏡接觸樣品時,溫度至少降低 3°C,並且永遠不會(hui) 回到 37°C,因為(wei) 物鏡連接到顯微鏡主體(ti) ,顯微鏡主體(ti) 在室溫下位於(yu) 腔室外部。VAHEAT 用於(yu) 表征溫度下降並補償(chang) 物鏡的冷卻效果。開啟 VAHEAT 後,熱沉效應僅(jin) 在前 10 秒內(nei) 出現,當溫度降至 36.2°C 時,儀(yi) 器反饋回路會(hui) 對其進行校正。這樣,樣品始終精確地保持在 37°C。b) 旋轉圓盤共焦裝置光學成像中心 Erlangen,數據采集地。


二、顯微鏡溫度控製的常規解決(jue) 方案


圖3 傳(chuan) 統生物溫度控製設備


傳(chuan) 統的溫度控製解決(jue) 方案沒有一種設備可以適合每個(ge) 對溫度敏感的實驗,往往需要根據特定的国产成人在线观看免费网站為(wei) 一個(ge) 顯微鏡係統購買(mai) 多個(ge) 設備,然後有益地組合在一起。目前主要的解決(jue) 方案有: 

(1) 顯微鏡周圍的大型環境箱。缺點是溫度測量距離樣品很遠,溫度變化可能非常緩慢。

顯微鏡需要幾個(ge) 小時才能達到熱平衡,緩慢的平衡也意味著與(yu) 溫度相關(guan) 的樣品漂移更顯著。

(2) 平台頂部孵化器/加熱平台插入物與(yu) 客觀加熱器相結合。當使用浸油物鏡時,這是一種有效但相當複雜且昂貴的解決(jue) 方案。

(3) 基於(yu) Peltier 元件的設備,具有無與(yu) 倫(lun) 比的溫度範圍,速度快且精確,但難以小型化,並且始終需要連接到元件上的散熱片,例如更大的金屬塊,這可能是不切實際的。

(4) 基於(yu) 液體(ti) 流動的設備。用途廣泛且運行速度快,但不是很人性化。

(5) 另一種選擇是自己構建溫度控製器。主要適用於(yu) 商業(ye) ,因為(wei) 其成本高且不具有普適性。


三、使用 VAHEAT 精確控製溫度


“VAHEAT”溫度控製係統操作簡單,且不必擔心校準或降低圖像質量的問題,更重要的是可精確控製視場中的實際樣品溫度,並適用於(yu) 單分子和超分辨率研究等高靈敏度顯微鏡国产成人在线观看免费网站設備。該裝置由四部分組成,分別是:(1)智能基底(2)顯微鏡適配器(3)探測頭(4)控製單元。核心部件是智能基底,這是一個(ge) 可交換的部件,包含一個(ge) 精確的四點溫度探頭和一個(ge) 透明的薄膜加熱元件(如圖4所示)。使用 VAHEAT,溫度可以高達每秒 100°C 的速率變化,穩定誤差在遠低於(yu) 0.1°C 的設定值,且無需對顯微鏡進行任何修改。VAHEAT 的核心是智能基板,功能化顯微鏡玻璃蓋玻片,其中靈敏的溫度探頭和透明加熱元件連接成一個(ge) 有源反饋回路。Smart substrates 每秒讀取和調節樣品溫度 83 次,確保它在不受環境條件影響的情況下精確地保持在設定值。Smart Substrates 還提供帶液體(ti) 樣品容器的版本。該設備允許對類似於(yu) PCR 循環儀(yi) 的任意溫度曲線進行編程,並且與(yu) 微流體(ti) 兼容。雖然主要用於(yu) 倒置配置中的高 NA 物鏡,除此之外,VAHEAT 係統的模塊化允許將其安裝在絕大多數光學顯微鏡上。


我們(men) 選擇了由氧化銦錫 (ITO) 製成的透明薄膜元件和直接內(nei) 置在單個(ge) 芯片中的溫度探頭的加熱策略,蓋玻片,樣品安裝在其上,見圖 3,這種基於(yu) ITO 層的加熱解決(jue) 方案有利於(yu) 熱均勻性。


圖 4:a) VAHEAT 組件。該設備由智能基板 (1) 智能基底 (2)顯微鏡適配器 (3) 探測頭 (4)控製單元。b) 智能基板是功能化蓋玻片,帶有透明的納米加熱元件和直接在視野中的溫度探頭。c) 當 VAHEAT 設置為(wei) 60°C 時,智能基板的熱圖像顯示整個(ge) 區域均勻加熱。


圖 5:智能基板,VAHEAT 中使用的透明加熱元件(基底可定製)


由於(yu) VAHEAT 僅(jin) 加熱少量樣品,因此它可以在高溫下與(yu) 高 NA 浸油物鏡一起使用。在一項實驗中,我們(men) 使用尼康 TIRF 100x/1.49 NA 物鏡在 75.0°C 下運行 VAHEAT 六小時,物鏡在前三個(ge) 小時內(nei) 由5°C 升溫至 29°C 並達到平衡,這表明 VAHEAT 可在更高的實驗溫度下使用。同時,VAHEAT 可以幫助所有生命科學家進行溫度敏感實驗,對於(yu) 某些領域,例如嗜熱微生物的實時成像、熱響應聚合物的表征或 DNA 納米技術,它是一項突破性技術,可以實現以前無法實現的實驗。自 2020 年推出以來,已開始使用我們(men) 的設備的 50 個(ge) 實驗室和国产黄色在线观看在各個(ge) 領域開展工作,例如單分子生物物理學、膠體(ti) 化學和細胞生物學。他們(men) 使用 VAHEAT 研究相變、液晶、脂質層和囊泡以及人工細胞、ji端微生物、熱休克反應或溶液中的 DNA 和蛋白質。引用我們(men) 設備的第1批出版物現已發布。VAHEAT 被 Guillaume Baffou 教授(菲涅爾研究所)的實驗室用於(yu) 嗜熱細菌的活細胞成像,以研究限製對細菌生長的影響1。在 Wolfgang Zachariae 博士(生物化學領域的 MPI)的團隊中,在一個(ge) 關(guan) 於(yu) 驅動減數分裂的機製的研究項目中,VAHEAT 被用於(yu) 通過共聚焦顯微鏡對酵母中的溫度敏感等位基因進行熱休克和活細胞成像2。VAHEAT 還被用於(yu) 在 Henrik Dietz 教授(慕尼黑工業(ye) 大學)的實驗室中使用 DNA 折紙創建人工大分子傳(chuan) 輸的研究。該研究使用單分子 TIRF 成像進行檢測3。


使用即插即用的 VAHEAT 係統,從(cong) 實驗中導出溫度記錄也非常簡單。因此,我們(men) 希望該設備不僅(jin) 能夠實現新型實驗,而且有助於(yu) 改進成像實驗的報告和可重複性,從(cong) 而為(wei) 每個(ge) 人提供高靈敏度顯微鏡。


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參考文獻:

1. Molinaro, C., et al., Are bacteria claustrophobic? The problem of micrometric spatial confinement for the culturing of micro-organisms. RSC Advances, 11, 12500–12506 (2021).

2. Mengoli, V., et al., Deprotection of centromeric cohesin at meiosesis II requires APC/C activity but not kinetochore tension. The EMBO Journal, 40, e106812 (2021).

3. Stömmer, P., A synthetic tubular molecular transport system. Nature Communications, 12, 4393, (2021).