SPINDLE 3D高分辨率單分子定位顯微鏡可在不改變現有顯微鏡光路的基礎上實現高精度3D成像，可捕捉到小至橫向尺寸10 nm、軸向尺寸15 nm的細節。結合3DTRAX軟件對3D圖像進行重建和分析，可在不需要掃描的條件下即時捕獲 3D 信息，得到較佳的深度和精度3D圖像。當與(yu) 其他工具和技術，包括STORM、PALM、SOFI、光片顯微、寬場、寬場顯微、TIRF、FRET等一起使用時，可釋放巨大的潛力，適用於(yu) 活細胞、固定細胞和全細胞成像、單分子、粒子跟蹤和粒子計數等国产成人在线观看免费网站。
無需掃描! SPINDLE可實現3D高精度單分子定位成像！
介紹
超分辨率顯微成像是一係列能夠使研究人員能夠“打破”光學顯微鏡衍射障礙的方法，在該係列方法中分辨率較高的技術為(wei) 光激活定位顯微技術（PALM）。這些方法依賴於(yu) 在數千幀中對單個(ge) 分子的隨機子集進行定位（SMLM），並將這些個(ge) 體(ti) 的定位重構為(wei) 單個(ge) 超分辨率圖像。傳(chuan) 統的定位顯微鏡可以在橫向維度上進行10~20nm的精確成像，為(wei) 了實現更高的定位精度，要求顯微鏡配置具有更高信噪比的靈敏探測器。盡管橫向分辨率令人印象深刻，但傳(chuan) 統的2D SMLM仍通常缺乏軸向分辨率。
美國Double Helix Optics国产黄色在线观看的SPINDLER係列3D顯微鏡成像模塊與(yu) 3DTRAXR軟件相結合，可在三維尺度上實現高精度、亞(ya) 衍射極限定位，並具有擴展的深度成像能力。SPINDLE采用精密光學器件設計，可與(yu) 市麵上在售的科學顯微鏡無縫集成，並提供較佳的橫向和軸向精密成像組合。用戶可根據具體(ti) 的国产成人在线观看免费网站選擇合適的相位掩模版以實現基於(yu) 深度範圍、發射波長和信噪比等參數對點擴散函數（PSF）的優(you) 化，更重要的是，SPINDLE可在無需掃描的情況下在單張圖像中將傳(chuan) 統成像係統的景深擴大10倍。
在本文中，我們(men) 展示了如何將SPINDLE成像係統與(yu) 傳(chuan) 統熒光顯微鏡結合使用以在所有三個(ge) 維度（x、y、z）上實現亞(ya) 衍射極限成像。SPINDLE可與(yu) 任何高質量的科學相機兼容，無論是emccd還是scmos都可以提供定位顯微鏡所需的高信噪比圖像。
使用SPINDLE和DH-PSF相位掩模版對細胞微管進行三維超分辨成像
在本文中，我們(men) 證明了使用SPINDLE單通道模塊可以實現高精度、大深度的超分辨率重建。如圖1所示，使用Double Helix (DH-PSF) 的相位掩模版與(yu) SPINDLE單分子定位顯微鏡組件結合。係統將單個(ge) 分子發出的光分成兩(liang) 個(ge) 光瓣，通過找到兩(liang) 個(ge) 光瓣的中心來檢索發光點的橫向（x-y）位置；兩(liang) 光瓣之間的角度編碼了發光點的軸向（z）位置。這些額外的信息將有助於(yu) 在橫向和軸向尺寸上以非常高的精度（<20nm）進行超分辨率重建。此外，SPINDLE擴展了分子可以定位的景深，這種精確度和擴展深度成像的結合能夠以顯著提高的z軸分辨率以收集更多的數據。
圖1：基於(yu) 單分子定位顯微成像技術（SMLM）技術的帶有可互換相位掩模支架的SPINDLE模塊
為(wei) 了演示SPINDLE的工作原理，我們(men) 使用NikonN-STORM顯微鏡結合photometrics Prime 95B相機對被AlexaFluor 647偶聯微管蛋白抗體(ti) 標記的Cos7細胞進行了成像。對於(yu) 該樣品，我們(men) 使用經過優(you) 化的相位掩模版，該掩模版可與(yu) 遠紅外波長染料和1.49 NA的100倍物鏡配合使用。樣品在640 nm激光連續照射下在Prime95B上成像，曝光時間為(wei) 30 ms。使用3DTRAX軟件對單發射點進行定位，並將結果導出到ImageJ插件Thun-der STORM。使用歸一化高斯方法重建圖像，並使用ImageJ查找表“Spectrum”以顏色對z深度進行編碼。
圖2：單個(ge) 100nm珠在Prime95B上使用SPINDLE在焦平麵（0µm）和焦平麵上方（+1µm）和下方（-1µm）微米處的成像圖。
重建的結果包含超過200萬(wan) 個(ge) 定位，並顯示Cos7細胞中微管的30µmx30µm視野、深度超過2.1µm的範圍（圖3左）。深度以顏色編碼，細胞底部為(wei) 紅色/紫色，頂部附近為(wei) 黃色/橙色。放大的插圖顯示微管在一定深度範圍內(nei) 得到了很好的重建（圖3，右）。這些數據突出了使用Double Helix SPINDLE模塊帶來的擴展景深成像和高橫向和軸向分辨率。
使用Double Helix 3DTRAX軟件進行高精度三維定位
Double Helix 3DTRAX軟件是一個(ge) ImageJ/FIJI插件，其可以在橫向和軸向以亞(ya) 衍射極限精度定位單個(ge) 分子。3DTRAX還使用克拉美-拉奧下限(CRLB)5計算了每個(ge) 定位分子的精度值。該計算基於(yu) 每個(ge) 定位的信噪比。
圖3：使用SPINDLE(R)和Prime 95B成像的微管三維超分辨率重建圖。左圖：Cos7細胞免疫染色的微管蛋白，顏色編碼深度。右圖：左側(ce) 圖像的放大區域，顯示了深度超過2微米的微管。圖片由Double Helix Optics提供。平均CRLB值橫向約10nm，軸向約20nm（圖3）。
概括
Double Helix的SPINDLE超分辨率3D顯微成像模組、相位掩模和3DTRAX軟件的組合可實現高精度大深度三維成像、跟蹤和計數。在此国产成人在线观看免费网站中，我們(men) 在亞(ya) 細胞結構的三維超分辨率重建中展示了大約10nm的橫向精度和20nm的軸向精度。SPINDLE係列国产欧美在线為(wei) 研究人員提供了強大的工具集，可促進對廣泛生物係統中分子結構、亞(ya) 細胞和細胞內(nei) 相互作用的理解。
圖4：橫向和軸向精度。用於(yu) 重建圖2所示圖像的定位精度值。精度值由3DTRAX軟件根據其信噪比使用每個(ge) 發射器的Cramer-Rao下界5計算得出。定位數顯示在y軸上，精度值(nm)顯示在x軸上。
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