本文簡單介紹了點擴散函數（PSF）工程在熒光顯微鏡分辨中的国产成人在线观看免费网站。使用空間光調製器（SLM）對熒光顯微鏡進行校準，產(chan) 生一個(ge) 遠低於(yu) 衍射極限的波前誤差。從(cong) 而提高成像係統的分辨率。
純相位空間光調製器在PSF工程中的国产成人在线观看免费网站
一、引言
2014年諾貝爾化學獎揭曉，美國及德國三位科學家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner獲獎。獲獎理由是“研製出超分辨率熒光顯微鏡”，從(cong) 此人們(men) 對點擴散函數 (PSF) 工程的認識有了顯著提高。
Moerner 展示了 PSF 工程與(yu) Meadowlark Optics SLM 的使用案例，用於(yu) 熒光發射器的超分辨率成像和 3D 定位。 PSF工程已被證明使顯微鏡能夠使用多種成像模式對樣本進行成像，同時以非機械方式在模式之間變化。這允許對具有弱折射率的結構進行成像，以及對相位結構進行定量測量。 已證明的成像方式包括：螺旋相位成像、暗場成像、相位對比成像、微分幹涉對比成像和擴展景深成像。
美國Meadowlark Optics 国产黄色在线观看專(zhuan) 注於(yu) 模擬尋址純相位空間光調製器的設 計、開發和製造，有40多年的曆史，該国产黄色在线观看空間光調製器国产欧美在线廣泛国产成人在线观看免费网站於(yu) 自適應光學，散射或渾濁介質中的成像，雙光子/三光子顯微成像，光遺傳(chuan) 學，全息光鑷(HOT)，脈衝(chong) 整形，光學加密，量子計算，光通信，湍流模擬等領域。其高分辨率、高刷新率、高填充因子的特點適用於(yu) PSF工程国产成人在线观看免费网站中。
圖1. Meadowlark 2022年新推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM
二、空間光調製器在PSF工程中的技術介紹
在單分子定位顯微鏡（SMLM）中，通過從(cong) 相機視場中稀疏分布的發射點來估計單個(ge) 分子的位置，從(cong) 而克服了分辨率的衍射限製。可實現的分辨率受到定位精度和熒光標簽密度的限製，在實踐中可能是幾十納米的數量級。有科研團隊已經將這種技術擴展到三維定位。通過在光路中加入一個(ge) 圓柱形透鏡或使用雙平麵或多焦點成像，可以估算出分子的軸向位置。光斑的拉長（散光）或光斑大小的差異（雙平麵成像）對軸向位置進行編碼。將空間光調製器（SLM）與(yu) 4F中繼係統結合到成像光路中，可以設計更廣泛的點擴散函數（PSF），為(wei) 優(you) 化顯微鏡的定位性能提供了可能。
利用空間光調製器（SLM）對熒光顯微鏡進行校準，可以建立一個(ge) 遠低於(yu) 衍射極限的波前誤差，SIEMONS團隊就利用Meadowlark空間光調製器實現了高精度的波前控製。原理證明和實驗顯示，在1微米的軸向範圍內(nei) ，在x、y和λ的精度低於(yu) 10納米，在z的精度低於(yu) 20納米。對這篇文獻感興(xing) 趣的話可以聯係我們(men) 查閱文獻原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》
下麵我們(men) 來具體(ti) 看看是如何国产成人在线观看免费网站的，以及国产成人在线观看免费网站效果如何。
圖2. A）SLM校準分支和通過光路的偏振傳(chuan) 輸示意圖。額外的線性偏振濾波器沒有被畫出來，因為(wei) 它們(men) 與(yu) 偏振分光器對齊。B）相機上的強度響應作為(wei) λ/2-板不同方向α的SLM的相位延遲的函數。C) 光學裝置的示意圖。一個(ge) 帶有SLM的中繼係統被添加到顯微鏡的發射路徑中（紅色），一個(ge) 單獨的SLM校準路徑（綠色）被納入發射中繼係統中。這允許在實驗之間進行SLM校準。BE：擴束器，DM：分色鏡，L：鏡頭，LPF：線性偏振濾鏡，M：鏡子。OL：物鏡，PBS：偏振分光鏡，TL：管鏡。
光路如上圖2所示，包括一台尼康Ti-E顯微鏡，帶有TIRF APO物鏡（NA = 1.49，M = 100），一個(ge) 200毫米的管狀鏡頭，一個(ge) 帶有SLM的中繼係統被建立在顯微鏡的一個(ge) 出口端口。中繼係統包括兩(liang) 個(ge) 消色差透鏡，一個(ge) 向列型液晶空間光調製器（LCOS）SLM（Meadowlark，XY係列，512x512像素，像素大小=15微米，設計波長=532納米）和一個(ge) 偏振分光器，用於(yu) 過濾未被SLM調製的X偏振光。第1個(ge) 消色差透鏡在SLM上轉發光束。
第二個(ge) 中繼鏡頭確保在emccd上對熒光物體(ti) 進行奈奎斯特采樣。顯微鏡配備了一套波長為(wei) 405nm、488nm、561nm和642nm的合束激光器。
這個(ge) 配置增加了一個(ge) 用於(yu) 校準SLM的第二個(ge) 光路。這個(ge) 空降光調製器校準光路是為(wei) 測量入射到SLM上的X和Y偏振光之間的延遲差而設計的，為(wei) 了測量某個(ge) SLM像素的調製，需要將SLM映射到校準路徑的相機上。這種映射是通過在SLM上施加一個(ge) 電壓增加的棋盤圖案來獲得的。平均捕獲的圖像和沒有施加電壓時的圖像之間的差異被用作角落檢測算法（來自Matlab - Mathworks的findcheckerboard）的輸入，以找到角落點。對這些點進行仿生變換，並用於(yu) 找到對應於(yu) 每個(ge) SLM像素的cmos像素。
圖3. SLM校準程序。A) 單個(ge) SLM像素的測量強度響應作為(wei) 国产成人在线观看免费网站電壓的函數。每一個(ge) 極值都對應於(yu) 等於(yu) π的整數倍的相位變化，並擬合一個(ge) 二階多項式以提高尋找極值的精度。強度被分割成四個(ge) 部分，它們(men) 被縮放為(wei) [0 1]。這個(ge) 歸一化的強度（B）被轉換為(wei) 相位（C），並反轉以創建該特定電壓段和像素的LUT（D）。E）20個(ge) 隨機選擇的SLM像素的歸一化強度響應，顯示像素間的變化。F) 測量的波前均方根誤差是校準後立即使用校準LUT的相位的函數，45分鍾後，以及製造商提供的LUT。G) 在不同的恒定相位下，用於(yu) 成像光路的SLM部分的LUTs。暗點表示沒有3個(ge) zui大值的像素。H) 測量的平均相位和預定相位之間的差異作為(wei) 預定相位的函數。
圖3解釋了SLM像素的校準程序。首先，以256步測量作為(wei) 国产成人在线观看免费网站電壓函數的強度響應，產(chan) 生一連串的zui小值和zui大值，它們(men) 對應於(yu) π或2π的遲滯。在被照亮的SLM平麵內(nei) 的所有像素似乎有三個(ge) zui大值，這意味著總的相位調製為(wei) 4π或1094納米。這些極值出現的電壓是通過對極值附近的三個(ge) 點進行擬合拋物線來找到的，這增加了精度，並充分利用了SLM的16位控製。然後，強度被分為(wei) 四段，用公式（11）的逆值對這些段進行縮放並轉換為(wei) 相位。相位響應被用來為(wei) 每個(ge) SLM像素構建一個(ge) 單獨的查找表（LUT），以補償(chang) SLM的非均勻性。LUT參數在SLM上平滑變化，並與(yu) 肉眼可見的法布裏-珀羅條紋大致對應，表明相位響應的差異是由於(yu) 液晶層厚度的變化造成的。額外的像素與(yu) 像素之間的變化可能來自底層矽開關(guan) 電路的像素與(yu) 像素之間的變化。完整的校準需要大約5分鍾（在四核3.3GHz i7處理器上的3分鍾掃描和2分鍾計算時間），但原則上可以優(you) 化到運行更快。
實驗結果：
圖4 測量的PSF與(yu) 矢量PSF模型擬合之間的PSF比較。G-I）平均測量的PSF是由大約108個(ge) 光子攜帶的信號通過上采樣（3×）和覆蓋所有獲得的斑點編製而成。比例尺表示1μm。
圖4顯示PSF模型的預測結果。通過這種方式，實驗的PSF是由∼108個(ge) 光子的累積信號建立起來的。實驗和理論上的矢量PSF之間的一致性通常是非常好的，甚至在離焦值的邊緣結構也是非常匹配的。剩下的差異，主要是光斑的輕微變寬，是由於(yu) 入射到相機上的光的非零光譜寬度，由於(yu) 發射光譜的寬度和四帶分色器的帶通區域的寬度。邊緣結構中也有一個(ge) 小的不對稱性，這可能是由光學係統中殘留的高階球差造成的。
所有工程PSF的一個(ge) 共同特點是，與(yu) 簡單的二維聚焦斑點相比，它們(men) 的複雜性必須在PSF模型中得到體(ti) 現，該模型被用於(yu) 估計三維位置（可能還有發射顏色或分子方向）的參數擬合算法。簡化的PSF模型，如高斯模型、基於(yu) 標量衍射的Airy模型、Gibson-Lanni模型，或基於(yu) Hermite函數的有效模型都不能滿足這一要求。一個(ge) 解決(jue) 方案是使用實驗參考PSF，或用花樣擬合這樣的PSF作為(wei) 模型PSF，或者使用一個(ge) 或多個(ge) 查找表（LUTs）來估計Z-位置。矢量PSF模型也可以用於(yu) 複雜的3D和3D+λ工程PSF。眾(zhong) 所周知，矢量PSF模型是高NA熒光成像係統中圖像形成的物理正確模型。複雜的工程PSF的另一個(ge) 共同特點是對擾亂(luan) 設計的PSF形狀的像差的敏感性，並以這種方式對精度和準確性產(chan) 生負麵影響。為(wei) 了實現精確到Cramér-Rao下限（CRLB），即無偏估計器的精度，光學係統的像差水平應該被控製在衍射極限（0.072λ均方根波前像差），這個(ge) 條件在實踐中往往無法滿足。因此，需要使用可變形鏡或為(wei) 產(chan) 生工程PSF而存在的SLM對像差進行校正。自適應光學元件的控製參數可以使用基於(yu) 圖像的指標或通過測量待校正的像差來設置。後者可以通過基於(yu) 引入相位多樣性的相位檢索算法來完成，通常采用通焦珠掃描的形式。這已經在高數值孔徑顯微鏡係統、定位顯微鏡中實現，並用於(yu) 提高STED激光聚焦的質量。
三、PSF国产成人在线观看免费网站對液晶空間光調製器的要求
1.光利用率
對於(yu) 這個(ge) 国产成人在线观看免费网站來說，SLM將光學損失降到非常低是很重要的。PSF工程使用SLM來操縱顯微鏡發射路徑上的波前。在不增加損失的情況下，熒光成像中缺乏信號。使用具有高填充係數的SLM可以大限度地減少衍射的損失。
Meadowlark国产黄色在线观看能提供標速版95.6%的空間光調製器，分辨率達1920x1200，高刷新率版像素1024x1024，填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到100%，一級衍射效率可以做到98%。高分辨率能在滿足創建複雜相位函數的同時，能夠提升係統的光利用率。
2.刷新率（可達1K Hz）
高速度可以實現實時的深層組織超分辨率成像。可見光波段可達1K Hz刷新速度（@532nm）。
3.分辨率（1920x1200）
高分辨率的SLM是創建三維定位所需的複雜相位函數的理想選擇，如此能夠對每個(ge) 小像元區域的光場進行自由調控。
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