拉曼效應最早是在20世紀20年代由拉曼C.V發現的。它是一種廣泛用於(yu) 測定分子振動模式的光譜方法。與(yu) 其他分析化學方法相比，光譜
方法提供高空間分辨率，不需要直接接觸來獲取化學信息。振動光譜提供了合理的化學特殊性，不需要額外的標記物。而自發拉曼光譜
學是一個(ge) 弱散射過程。成像和顯微鏡的国产成人在线观看免费网站，一個(ge) 單一的視野可能要花費數小時的信號積分時間。因此，相幹拉曼散射方法，如受激拉
曼散射效應, 現在廣泛国产成人在线观看免费网站於(yu) 拉曼成像中。在本国产成人在线观看免费网站中, 我們(men) 將描述Moku:Lab的鎖相放大器是如何在波士頓大學先進的受激拉曼成像
裝置中實現的。
介紹
拉曼光譜法是一種非破壞性分析化學方法。它直接探測樣品的振動模式。與(yu) 電子光譜法相比，拉曼光譜法無需熒光標記即可提供高化學
特異性。可以完全無接觸和無標簽的方式測試樣品，從(cong) 而防止對係統的幹擾。紅外光譜是獲得振動光譜的另一種常用方法。紅外光譜和
拉曼光譜的選擇規則是不同的。紅外光譜對偶極子的變化很敏感，而拉曼光譜對極化率的變化敏感。這使得IR和拉曼成為(wei) 用於(yu) 特定化學
鍵組的良好工具。對於(yu) 成像和顯微鏡国产成人在线观看免费网站，在紅外或拉曼光譜之間進行選擇時，還要考慮兩(liang) 個(ge) 其他重要因素：1）空間分辨率需求。紅
外光譜法使用紅外光作為(wei) 光源。拉曼可以使用可見光或近紅外（NIR）激光器進行激發。由於(yu) 可見光或NIR激光的波長要很短，因此拉
曼顯微鏡的空間分辨率可以達到亞(ya) 微米範圍。另一方麵，IR光具有幾微米的波長。對於(yu) 許多顯微鏡国产成人在线观看免费网站來說，空間分辨率被認為(wei) 是差
的。 2）水在紅外區域具有很強的吸收能力。對於(yu) 富含水的環境（例如生物樣品），IR可能遭受強烈的吸收，因此在某些情況下首選拉
曼。
與(yu) 占主導地位的瑞利散射相比，拉曼散射非常弱。 為(wei) 了獲得合理的信噪比，通常需要幾秒鍾的長積分時間。 對於(yu) 常規光譜來說，這可
能不是問題，但是對於(yu) 光譜成像而言，可能需要幾個(ge) 小時才能獲得一個(ge) 單一的視野。為(wei) 了增強信號，這些年來已經開發了幾種不同的方
法。基於(yu) 等離激元的方法，例如表麵增強拉曼光譜，進一步將檢測極限降低到單分子水平。相反，納米顆粒誘導的不均勻性使其難以成
像。 對於(yu) 成像科學家來說，更有前景的方法是增強非線性光學的相幹拉曼散射方法：受激拉曼散射（SRS）和相幹反斯托克斯拉曼散
射（CARS）。
相幹拉曼效應最早是在1960年代發現的。在1990和2000年代末，由於(yu) 超快鎖模激光器的進步，謝尼（Sunney Xie）及其同事率先將
CARS9和SRS10用於(yu) 無標記化學顯微鏡。從(cong) 那時起，這些技術已廣泛用於(yu) 化學，生物學和材料科學研究。 CARS和SRS有很多相似之
處。這些非線性光學過程通常在相同條件下發生，並且儀(yi) 器設置幾乎相同。但是，有一些差異。就像自發的拉曼一樣，CARS信號（圖
1中的ω為(wei) 反斯托克斯）與(yu) 入射光束（ωp，泵浦，ωs斯托克斯）的波長不同，使用短通濾波器很容易將信號從(cong) 入射光中分離出來。
到達檢測器的光子總量很小，因此使用更靈敏的光子檢測器（例如光電倍增管（PMT））進行檢測。但是，CARS受其他非共振非線性
光學效應所產(chan) 生的背景的影響。 這些影響不僅(jin) 限製了CARS測量的實際檢測極限，而且使光譜失真（與(yu) 分子振動共振相比）。 另一方
麵，SRS信號不受大多數其他非線性光學效應的幹擾。 但是，SRS是受激發射過程。 信號以入射光相同的波長發生。 SRS效應僅(jin) 略微
增加/減少了斯托克斯束和泵浦束的光子數量。 這些變化很小，以至於(yu) 無法通過常規的時域測量方法進行測量。 因此，SRS需要具有鎖
相檢測功能的光泵浦探測技術。
光學泵浦探測技術和鎖定檢測：
泵浦探針法是用於(yu) 多光子檢測過程的一種普遍采用的方法。該實驗通常涉及兩(liang) 束超快(皮秒或飛秒)激光束，一束光一直照, 而第二束光
束以恒定頻率進行AM調製。因此，由第二束引起的變化或擾動都會(hui) 以調製頻率被傳(chuan) 遞到第一束。在探測器上, 用一個(ge) 光學濾波器來阻
擋已調製的光束。僅(jin) 檢測到未調製的波長。作為(wei) 信號僅(jin) 發生在調製頻率附近，通常使用鎖相放大器（LIA）來放大信號。鎖相放大器使
用零差檢測方法，將輸入信號與(yu) 正弦波本振混合在一起再調製頻率。隨後，它通過低通濾波器和電壓放大器（可選）發送信號，並輸出
到數字化儀(yi) 或示波器。這樣可以確保僅(jin) 放大和檢測與(yu) 調製頻率非常接近的信號。拒絕其他頻率的信號（例如激光重複頻率或DC 背
景）。這使得鎖相放大器成為(wei) 檢測泵浦探頭的必不可少的工具，可以在一下視頻中找到相關(guan) 鎖相放大器的更多詳細說明：
https://youtu：.be/H2O2ADqEkHM 和 https://youtu.be/M0Q91_ns2Cg.
特別是對於(yu) SRS，兩(liang) 個(ge) 光束（泵浦和斯托克斯）的能量差與(yu) 目標拉曼位移精確匹配。理論上, 泵浦或斯托克斯都可以調製，而另一束用
於(yu) 檢測。如果對泵浦光束調製，則在泵浦光束處於(yu) 開啟狀態時，SRS過程會(hui) 導致斯托克斯光束稍微增加。在檢測中，泵浦光束被阻擋
，僅(jin) 斯托克斯光束被檢測到。這被稱為(wei) 受激拉曼增益(SRG)檢測。如果斯托克斯束被調製，則在斯托克斯束接通的情況下，SRS過程會(hui)
導致泵浦光束略微減小。在探測器處，斯托克斯光束被阻擋，並且隻有泵束被檢測到。這稱為(wei) 受激拉曼損耗（SRL）檢測。對於(yu) 本国产成人在线观看免费网站
筆記中提供的示例用例，由於(yu) 將光檢測器針對泵浦波長進行了優(you) 化，因此實施了SRL方案。
實驗設置
激光
SRS的產(chan) 生需要兩(liang) 個(ge) 超快激光脈衝(chong) 在樣品上空間和時間上重疊。為(wei) 了獲得穩定的時間重疊，當今的SRS顯微鏡通常使用單個(ge) Ti：藍寶石
激光可產(chan) 生泵浦光束和斯托克斯光束。皮秒和飛秒激光器均可用於(yu) SRS測量。皮秒激光器提供了更精細的光譜輪廓。無需額外的光學器
件即可實現高光譜分辨率。與(yu) 自發拉曼光譜不同，自發拉曼光譜可以用單色激光同時測量所有拉曼光譜，而受激拉曼光譜則需要進行波
長調整以測量其他光譜點，並且在獲取光譜圖像時調整激光波長會(hui) 限製測量速率。另一方麵，飛秒激光器本身具有廣譜。可以使用一種
稱為(wei) “光譜聚焦”的技術來快速調整泵和斯托克斯束之間的能量差。可以在更短的時間內(nei) 獲取光譜圖像。但是，這種方法增加了係統的
光學複雜性。需要在光束路徑中添加一對衍射光柵或高折射率材料（例如SF57玻璃棒），讓光譜範圍受到限製。有關(guan) 頻譜聚焦方法的
詳細說明可以在最近的出版物中找到。
簡而言之，如果一次關(guan) 注單個(ge) 拉曼位移，則皮秒激光的設置要簡單得多。飛秒激光器是快速高光譜圖像采集的首選，但係統比較複雜
性。 Moku：Lab LIA可以與(yu) 皮秒和飛秒激光器配對使用。在本文中介紹的用例中，飛秒激光器（Spectra-physics Mai Tai）與(yu) SF57
玻璃棒一起用於(yu) 光譜聚焦。
調製，延遲階段和掃描：
泵浦和斯托克斯束通常由聲光調製器（AOM）或電光調製器（EOM）進行調製。調製頻率通常在MHz範圍內(nei) 。這有助於(yu) 減少由光熱
膨脹產(chan) 生的背景並提高圖像采集速度。在本国产成人在线观看免费网站筆記中，泵浦光束是由AOM在2 MHz左右調製的。為(wei) 了使泵浦和斯托克斯光束在時間
上保持一致，一個(ge) 電動的延遲用於(yu) 調整任一或兩(liang) 個(ge) 光路驅動器的光路長度。
對於(yu) 具有光譜聚焦的飛秒SRS，延遲級還用於(yu) 微調泵浦和斯托克斯束之間的能量差。
像大多數其他非線性光學顯微鏡一樣，光束掃描方法通常用於(yu) CARS和SRS圖像采集。在物鏡之前放置一對振鏡或振鏡掃描頭。在本例中，使用了一對振鏡（GVS 102，Thorlabs）。
物鏡/聚光鏡，探測器和數據采集
在掃描頭後，將光束導向物鏡以在樣品上形成一個(ge) 緊密聚焦的點。為(wei) 了建立相幹拉曼散射的相位匹配條件，最好使用高數值孔徑
（NA）的水或油浸物鏡。然後沿向前方向收集光,將其重新聚焦到光電探測器上。確保收集效率，建議使用油浸物鏡。在本例中，使用
的是60X 1.2 NA水浸物鏡（UPLSASP 60XW，Olympus）。
一旦聚光器收集到光，然後將其重新聚焦到光學濾鏡之後的光電二極管上，以阻擋調製光束。然後，將來自光電二極管的信號發送到鎖
相放大器上（取決(jue) 於(yu) 光電二極管的配置，可能需要前置放大器/跨阻放大器）。鎖相放大器將信號與(yu) 本地振蕩器混合，然後將調製頻率
的交流信號轉換為(wei) 直流輸出。然後將其發送到數據采集係統以形成圖像。在此国产成人在线观看免费网站中，將Hamamatsu S3994-01與(yu) 自製的跨阻放大器
配對使用，以檢測濾光器之後的剩光。然後將信號發送到Moku：Lab的LIA，以進行交流信號放大和對話。使用外部（PLL）模式對輸
入進行了解調。混頻器之後使用了一個(ge) 7μs二階低通濾波器。然後，在10 dB增益之後，將解調後的信號發送到模擬輸出。 LIA的輸出
由NI DAQ係統數字化，圖像由家用NI虛擬儀(yi) 器生成。
結果和討論
為(wei) 了測試Moku：Lab的LIA性能，將一滴二甲亞(ya) 碸（DMSO）夾在兩(liang) 個(ge) 蓋玻片之間。 然後通過SRS顯微鏡對液滴的邊緣成像。 在掃描
頭之前，用798 nm泵浦（30 mW）和1 040 nm Stokes（1 50 mW）調諧激光器。在整個(ge) 光譜範圍內(nei) 總共采集了1 00張圖像。LIA的
時間常數設置為(wei) 7μs。圖4示出了液滴邊緣的X-Y輪廓，並且在右側(ce) 繪製了Z輪廓（拉曼光譜）。 可以清楚地觀察到由C-H鍵振動共振引
起的兩(liang) 個(ge) 主峰。
要訪問圖像的信噪比（SNR），請使用最亮的圖像（2930 cm-1附近）。 信噪比（SNR）由液滴區域中10×10框的平均強度超過背景
區域10×10框的標準偏差計算得出。觀察信SNR為(wei) 1100。
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