熒光成像是揭示生物標本分子組成zui為(wei) 廣泛的方式。然而，熒光探針的光學發射較弱以及在成像速度和靈敏度之間的權衡是攔在無模糊成像前的大山，例如活細胞和組織中亞(ya) 毫秒生化動態等快速現象。FIRE技術橫空出世，通過數字合成光場的拍頻將圖像映射到射頻頻譜中，可以將實時像素讀取速率比現代電子倍增器耦合器件——高速熒光成像技術的金標準快一個(ge) 數量級。MZI幹涉儀(yi) 配合聲光偏轉器以及聲光移頻器來獲取一維的掃描光束陣列。
聲光偏轉器（AODF）在高速熒光成像中的關(guan) 鍵作用：FIRE技術簡介
在上一篇文章中（https://www.weilancj.com/jishu-1142.html），我們(men) 學習(xi) 了發表在Science上的“High-Speed fluorescence Image-EnabLED Cell Sorting”，其中通過AODF實現了一種基於(yu) 高速熒光成像的細胞分選技術。而這份速度是由FIRE高速熒光成像係統帶來的，即使用射頻標記發射的熒光成像係統。zui初是由來自加州大學洛杉磯分校的Eric D. Diebold, Brandon W. Buckley等四位科學家於(yu) 2013年發表於(yu) Nature Photonics的“Digitally synthesized beat frequency multiplexing for sub-millisecond fluorescence microscopy”這篇論文中提及。
FIRE技術（fluorescence imaging using radiofrequency-tagged emission）是將一種射頻通信的方法国产成人在线观看免费网站於(yu) 高速熒光顯微鏡，同時結合了PMT的靈敏度和速度優(you) 勢，並利用頻域信號複用、射頻頻譜數字合成以及數字鎖相放大，實現了千赫茲(zi) 幀率的熒光成像，解決(jue) 了emccd或者scmos用於(yu) 流式細胞術速度不足的問題。而FIRE的核心特征在於(yu) 樣品上每個(ge) 單獨點均能夠以不同射頻激發熒光。在兩(liang) 束移頻激光之間幹涉所產(chan) 生的拍頻處，數字合成的射頻“標記”了熒光發射的各個(ge) 像素點。這和無線通信係統中的頻率多路複用類似，FIRE圖像的一行內(nei) 的每個(ge) 像素點都被分配了自己的射頻。單元光電探測器同時檢測多個(ge) 像素的熒光，並從(cong) 探測器輸出的頻率分量中重新構建圖像（運用數字域的並行鎖相放大來分辨）。
樣品中每個(ge) 點能以不同的射頻來激發熒光的秘訣在於(yu) 其中的馬赫-曾德爾幹涉儀(yi) （MZI），並使用聲光器件來執行拍頻激發多路複用。如上圖a所示，MZI一路的光通過聲光偏轉器（AODF）產(chan) 生頻移（帶寬為(wei) 100MHz），由射頻頻率梳驅動，相位經過設計以zui小化峰值-平均功率比。AODF產(chan) 生多個(ge) 偏轉光（+1級衍射光），包含一係列的偏轉角度和頻率偏移。MZI幹涉儀(yi) 第二路光通過聲光移頻器（AOFS），該移頻器由單個(ge) 射頻頻率驅動，提供本振（LO）光束。使用柱麵透鏡來匹配LO光束與(yu) 射頻梳光束的發散角。在MZI幹涉儀(yi) 輸出的位置，兩(liang) 束光通過分束器合並聚焦到樣品的一條水平線上，將頻率偏移映射到空間。
熒光在由幹涉儀(yi) 兩(liang) 路的差頻所定義(yi) 的各個(ge) 拍頻下被激發。樣品中的熒光發射由共聚焦配置的PMT檢測，並且通過狹縫來排除平麵外的熒光發射。共振掃描振鏡（RS）在橫向上進行高速掃描，即可以二維成像。考慮到熒光團的有限頻率響應，選擇LO光束的頻移將拍頻激發頻譜外差到基帶，以zui大限度利用調製帶寬。這是必要的，因為(wei) AOD通常在升頻的次倍頻通帶上工作，以避免諧波幹擾。用於(yu) 驅動AOD的射頻頻率梳的直接數字合成（DDS）定義(yi) 了每個(ge) 像素的激發，而這是通過特定的射頻和相位決(jue) 定的，從(cong) 而導致射頻頻率梳與(yu) 檢測信號之間的相位相幹性。而這種相位相幹性可以使用相敏數字鎖相放大器的並行陣列使得圖像多路分解，這可以在Matlab中實現。FIRE的並行讀出將導致zui大像素速率等於(yu) AODF的帶寬。
圖2顯示了FIRE顯微鏡的典型輸出。檢測到的時域信號(圖2a)是來自一排像素的射頻標記發射的傅裏葉疊加。使用短時傅裏葉變換計算的時間分辨頻譜(圖2b)揭示了樣本在水平行內(nei) 位置相關(guan) 的頻率成分。而樣本的垂直位置是從(cong) 2.2KHz共振掃描鏡的參考輸出中恢複出來的，zui終形成了二維的圖像（圖2c）。
在這裏AOD有三項指標至關(guan) 重要，可分辨點數（掃描角度），功率平坦化，掃描速度。AOD的帶寬越大，自然掃描的角度也越大，可分辨的點數也越多。掃描時間意味著不同頻率間切換的時間，自然也和成像的速度息息相關(guan) 。而功率平坦化是AOD晶體(ti) 和驅動器共同優(you) 化的結果，為(wei) 了在掃描的帶寬內(nei) 獲得近似的衍射效率，不會(hui) 使得掃描獲得的線性激光陣列中間亮兩(liang) 邊暗，提供均勻的激發光。
G&H聲光偏轉器（AOD）可以提供適用於(yu) 不同波長的型號，在不超過幾度的範圍內(nei) ，分辨出成百上千個(ge) 點，掃描時間可以快至幾微秒。G&H為(wei) AOD提供光束的精確空間控製，無論是執行1D或2D掃描還是執行固定角度的光束偏轉。我們(men) 的聲光偏轉器可在整個(ge) 掃描角度上提供高度均勻的衍射效率，並為(wei) 材料處理和數字成像等掃描国产成人在线观看免费网站提供一致的功率通過量。
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